论文摘要
目的克隆大鼠肾脏促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）基因片段,构建表达大鼠EPO的体外真核表达质粒pEGFP-N1/EPO；分离、培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchyma l stem cells，MSCs），将重组的表达质粒pEGFP-N1/EPO转染培养鉴定的大鼠MSCs，并检测其在体外大鼠MSCs中的表达,为联合EPO和MSCs治疗缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encepha lopathy,HIE）引起的脑损伤提供实验基础。方法1. pEGFP-N1/EPO真核表达载体的构建及鉴定：在无菌、无RNA酶污染的条件下利用宝生物RNAiso Reagent试剂提取出大鼠肾脏组织总RNA。利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出大鼠EPO基因cDNA片段，电泳分析结束后切胶回收纯化PCR产物，行上“A”处理并精制，回收产物使用TaKaRa DNA Liga tion Kit与pMD19-T Simple Vector连接后，转化入感受态大肠杆菌JM 109中，涂布LB琼脂平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒并命名为CTB865-T-1、CTB865-T-2送大连宝生物公司测序，测序结果使用BLAST软件与GeneBa nk数据库进行同源性分析。测序结果表明，CTB865-T-2质粒符合预期要求。然后将CTB865-T-2质粒与pEGFP-N1进行双酶切，使用TaKaRa DNA Liga tionKit中的连接酶，将CTB865-T-2中插入的目的片段与pEGFP-N1 Vector连接后，热转化至感受态大肠杆菌JM 109中，涂布LB琼脂平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒并命名为CTB866-P-1。使用HindⅢ/KpnⅠ对CTB866-P-1质粒进行双酶切电泳鉴定，并送上海生工行插入序列测序。分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchyma l stem cells, MSCs）无菌条件下取出SD大鼠完整的股骨、胫骨并除去所附的软组织,Percoll液密度梯度法分离大鼠MSCs原代细胞，DMEM/F12培养基加入10%标准胎牛血清培养大鼠MSCs细胞，待细胞融合约80%时，用0.25%胰酶消化传代培养行贴壁筛选，流式细胞仪鉴定培养至第五代大鼠MSCs细胞表面CD44、CD45、CD90的表达。3.重组表达质粒pEGFP-N1/EPO转染大鼠MSCs并检测EPO蛋白表达将测序结果正确的CTB866-P-1质粒，热转化至感受态大肠杆菌JM 109中，涂布LB琼脂平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取去内毒素重组质粒pEGFPN1/EPO，测定其浓度，然后在Lipofecta mineTM 2000的作用下转染大鼠MSCs细胞，转染后约48h-72h观察MSCs绿色荧光表达，行免疫组化和RT-PCR鉴定EPO蛋白在大鼠MSCs细胞中的表达情况。结果1.反转录聚合酶链反应成功获得大鼠EPO cDNA，TA克隆法经中间T质粒构建重组表达质粒pEGFP-N1/EPO，酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确。2.流式细胞术鉴定分离培养的大鼠细胞表达CD44、CD90，不表达CD45，与文献报道相符，提示成功分离培养大鼠MSCs。3.重组质粒pEGFP-N1/EPO在Lipofecta mineTM 2000下转染大鼠MSCs48h后，免疫组化检测到大鼠MSCs细胞胞浆EPO表达，RT-PCR后电泳显示在约579bp处出现阳性条带。结论利用TA克隆法能成功构建pEGFP-N1/EPO重组质粒；密度梯度法结合贴壁法能成功分离、培养、纯化大鼠MSCs；Lipofecta mineTM 2000方法介导转染重组质粒的大鼠MSCs胞浆能表达EPO蛋白。
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标签：促红细胞生成素论文; 真核表达载体论文; 骨髓间充质干细胞论文; 缺氧缺血性脑病论文;