水稻胚乳发育相关基因的筛选及功能分析

论文摘要

水稻在我国粮食生产中具有举足轻重的作用。除其经济价值重要外,水稻转化体系成熟、基因组相对较小、全基因组序列测序已完成,水稻已成为单子叶植物分子遗传研究的重要模式植物。稻米产量和品质的形成是个非常复杂的生理过程。胚乳是人们直接食用的部分,占精米的90%以上,胚乳发育直接影响着水稻的产量和品质。因此水稻胚乳发育相关基因的研究无论在基础理论还是在实际应用上都具有重要意义。首先,本研究利用水稻T-DAN插入启动子捕获标签,构建了25,000个水稻T-DNA插入启动子捕获突变体群体,对其中2,653个水稻T-DNA插入启动子捕获系进行了GUS（β-glucuronidase）报道基因表达检测,获得了GUS在各组织器官表达的63个水稻T-DNA插入启动子捕获系,其中水稻胚乳发育相关的T-DNA插入启动子捕获系24个,并对一个胚乳特异表达启动子捕获系进行了初步研究,这将为利用T-DNA插入启动子捕获系进行胚乳发育相关基因研究提供材料基础和理论依据。其次,本研究根据转录因子spf1序列同源克隆了大麦胚乳发育相关转录因子Susiba2（Sugar signaling in barley）以及水稻OsSusiba2基因,水稻OsSusiba2基因与大麦Susiba2基因有80%同源。本研究利用反义RNA和RNAi技术,构建OsSusiba2基因反义结构表达载体、OsSusiba2基因RNAi干扰表达载体及大麦Susiba2基因的过表达载体,用农杆菌介导法将它们导入水稻,利用其后代研究它们对水稻胚乳发育及淀粉代谢的影响。其主要研究内容和结果如下:一、水稻胚乳发育相关启动子捕获系的筛选1.构建启动子捕获植物表达载体pCAMBIA1300GUSA-Hyg,利用农杆菌介导法将其导入籼稻明恢86,获得了25,000个水稻T-DNA插入启动子捕获系。对2,872个T0代水稻启动子捕获系进行了标记基因潮霉素磷酸转移酶表达筛选,其中2,653个为阳性转基因水稻株系,阳性率达到92.4%。2.对2,653个水稻启动子捕获系进行了两次GUS报告基因表达检测表明:共有63个水稻启动子捕获系在其不同时期、不同器官包括根、茎、叶、颖花、胚、胚乳等组织中检测到GUS表达,占总数2.37%;其中GUS活性为胚乳倾向或优势表达的水稻启动子捕获系24个,占总数0.90%;GUS活性在胚中表达的水稻启动子捕获系9个,占总数0.34%;GUS活性在花药中表达的水稻启动子捕获系为20个,占检测总数0.70%,而在根、茎、叶和颖壳中表达分别为6个、18个、7个和5个。3.对63个部分T2代水稻启动子捕获系抗性基因分离比分析表明:39个中有28个水稻启动子捕获系为单T-DNA位点插入,占71.8%。Southern blot分析表明,水稻启动子捕获系w9101,w9106,w9154均为单拷贝。通过Tail-PCR扩增获得6个水稻胚乳发育相关启动子捕获系的侧翼序列并分析了插入位点详细信息。二、一个水稻胚乳特异表达启动子捕获系的初步分析1.对Tail-PCR扩增获得的水稻胚乳特异表达启动子捕获系w9101的侧翼序列分析发现,该T-DNA插入在水稻第6号染色体AP004750克隆的基因P0421H01.22和基因P0421H01.23之间,由于gus基因与基因P0421H01.23表达方向相同,表明w9101中GUS表达可能是P0421H01.23基因的启动子所起的。生物信息学分析表明: P0421H01.23基因编码一个由601个氨基酸组成的蛋白质,是一个肽转运子,编码的蛋白很可能是一个疏水性肽转运蛋白,跨膜区域和CHL1一样有12个α-螺旋跨膜区,这是肽转运蛋白家族的普遍特征,因此可推测P0421H01.23基因就是一个肽转运子（暂命名为OsPtr1）;进一步用生物信息学软件分析其启动子发现,它是一个具有胚乳特异性表达活性特征的启动子。2.RT-PCR结果分析表明:OsPtr1基因是一个胚乳特异性表达基因,并且T-DNA的插入使得OsPtr1基因功能缺失。OsPtr1基因和GFP融合表达亚细胞定位于质膜上。3.分离了OsPtr1基因的cDNA全长,并构建OsPtr1基因的过表达载体Gt1-OsPtr1,用农杆菌介导法获得其转基因水稻植株,southern blot分析表明OsPtr1基因已经整合到水稻基因组。4.稻米氮代谢相关物质含量分析表明:T-DNA插入使得启动子捕获系w9101的蛋白质含量及氨基酸含量都有一定程度的降低。和对照相比,三个转过表达OsPtr1基因水稻植株的蛋白质总量、17种氨基酸含量及氨基酸总量均有不同程度的增加。其中半必需氨基酸中精氨酸、6种必需氨基酸、谷氨酸、天门冬氨酸、蛋白质总量及氨基酸总量有较明显提高。三、Susiba2和OsSusiba2基因在水稻淀粉代谢调控中的功能分析1.构建OsSusiba2基因RNAi干扰和反义RNA植物表达载体,构建Susiba2基因过表达植物表达载体。获得以上三个植物表达载体的T4代转基因水稻纯合株系。2.转基因水稻植株southern blot分析表明:Susiba2基因过表达转基因水稻株系（SRB77和SRB80）以及OsSusiba2基因RNAi干扰转基因水稻株系SRI90为两个拷贝,OsSusiba2基因反义RNA转基因水稻株系（SRR11和SRR39）以及OsSusiba2基因RNAi干扰转基因水稻株系SRI86为单拷贝。3.转基因水稻植株northern blot分析表明:与对照相比,转反义OsSusiba2基因及其RNAi干扰的水稻株系内源淀粉分支酶表现出一定程度的抑制。转过表达Susiba2基因水稻株系内源淀粉分支酶表现出一定程度增强。4.糖诱导下转基因水稻的表达分析表明:在蔗糖和甘露醇处理下,野生型、转反义OsSusiba2基因水稻株系和转RNAi干扰OsSusiba2基因水稻株系叶片的内源淀粉分支酶表达基本没有什么变化外,转过表达大麦Susiba2基因水稻株系的蔗糖处理要比甘露醇处理的内源淀粉分支酶表达有所提高,说明Susiba2基因和OsSusiba2基因均受蔗糖诱导表达,而不受甘露醇的影响。5.转基因稻米直链淀粉含量分析表明:对照和转过表达Susiba2基因水稻的直链淀粉含量变化不大,转反义OsSusiba2基因及其RNAi干扰OsSusiba2基因水稻株系的直链淀粉含量均有明显下降的趋势,特别是OsSusiba2基因反义RNA转基因水稻株系SRR11和OsSusiba2基因RNAi干扰转基因水稻株系SRI86降幅较大。6.转基因水稻植株表型分析表明:对照和转过表达Susiba2基因水稻在表型上基本接近;转RNAi干扰OsSusiba2基因水稻株系和前两种相比无效穗数增多,而引起结实率、实粒数等下降;转反义OsSusiba2基因水稻株系则下降更为明显。7.转基因水稻的产量性状分析表明:转反义OsSusiba2基因及RNAi干扰OsSusiba2基因水稻株系比对照及过表达Susiba2基因水稻株系的单株瘪粒数明显增多,而单株实粒数和单株实粒重则明显减少,千粒重则无明显变化;转过表达Susiba2基因水稻株系和对照相比无较大变化;转反义OsSusiba2基因及RNAi干扰OsSusiba2基因水稻株系比过表达Susiba2基因水稻株系的单株穗数有明显的增多,而结实率和穗实粒数则明显减少。8.转基因水稻碳水化合物分配分析表明:转过表达Susiba2基因水稻根茎叶干重比较对照、转RNAi干扰OsSusiba2基因水稻株系和转反义OsSusiba2基因水稻株系均有所提高,说明转过表达Susiba2基因水稻可表现为更高的生物学产量。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 主要缩略词
• 引言
• 1. 立题背景
• 2. 文献综述
• 2.1 水稻突变体创制方法和应用
• 2.1.1 自然突变
• 2.1.2 物理和化学突变
• 2.1.3 T-DNA 插入突变
• 2.1.3.1 转座子插入突变
• 2.1.3.2 激活标签
• 2.1.3.3 捕获标签
• 2.2 胚乳发育分子生物学研究
• 2.3 淀粉代谢分子生物学研究
• 2.3.1 淀粉代谢相关酶研究
• 2.3.1.1 ADPG 焦磷酸化酶（AGPase）
• 2.3.1.2 淀粉合成酶
• 2.3.1.3 淀粉分支酶（SBE）
• 2.3.1.4 淀粉去分支酶（DBE ）
• 2.3.1.5 淀粉磷酸化酶（SP）
• 2.3.1.6 岐化酶（D-enzyme）
• 2.3.2 淀粉代谢调控研究
• 第一章、水稻胚乳发育相关启动子捕获系的筛选
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 水稻材料
• 1.1.2 水稻T-DNA 插入启动子捕获植物表达载体
• 1.1.3 实验所用引物
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.2.1 主要试剂
• 1.2.2 主要仪器设备
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 载体构建的一些基本方法
• 1.3.2 水稻农杆菌介导转化方法
• 1.3.3 水稻T-DNA 插入启动子捕获系抗性植株筛选
• 1.3.4 水稻T-DNA 插入启动子捕获系的PCR 分子检测
• 1.3.5 水稻T-DNA 插入启动子捕获系的GUS 表达检测
• 1.3.6 水稻T-DNA 插入启动子捕获系的southern blot 分子检测
• 1.3.7 水稻胚乳发育相关启动子捕获系侧翼序列的获得及分析
• 1.3.8 水稻胚乳发育相关启动子捕获系插入位点的验证
• 2. 结果与分析
• 2.1 农杆菌介导转法获得水稻T-DNA 插入启动子捕获系及抗性植株筛选
• 2.2 水稻T-DNA 插入启动子捕获系的PCR 分子检测
• 2.3 水稻T-DNA 插入启动子捕获系的GUS 表达检测
• 2.4 水稻T-DNA 插入启动子捕获系的遗传分析
• 2.5 水稻启动子捕获系的southern blot 检测
• 2.6 水稻胚乳发育相关启动子捕获系侧翼序列的获得及插入位点验证
• 2.7 水稻胚乳发育相关启动子捕获系候选基因的生物信息学分析
• 3. 讨论
• 3.1 水稻突变体创制的重要性
• 3.2 水稻启动子捕获体系建立
• 3.2.1 启动子捕获体系条件选择
• 3.2.2 启动子捕获的优点
• 3.3 水稻T-DNA 插入标签研究展望
• 第二章、一个水稻胚乳特异表达启动子捕获系的初步分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 水稻材料
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 质粒
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 OsPtr1 基因生物信息学分析
• 1.2.2 OsPtr1 基因RT-PCR 表达分析
• 1.2.3 Os Ptr1 基因分离
• 1.2.4 Os Ptr1 基因过表达载体构建及水稻转化植株获得
• 1.2.5 Os Ptr1 基因的亚细胞定位分析
• 1.2.5.1 无终止子OsPtr1 基因的扩增
• 1.2.5.2 OsPtr1-GFP 融合表达载体构建
• 1.2.5.3 基因枪法获得OsPtr1-GFP 融合蛋白的瞬时表达
• 1.2.6 水稻蛋白含量及氨基酸含量分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 OsPtr1 基因生物信息学分析
• 2.2 OsPtr1 基因的表达模式分析
• 2.3 OsPtr1 基因分离
• 2.4 OsPtr1-GFP 融合蛋白的载体构建
• 2.5 OsPtr1 基因的亚细胞定位
• 2.6 OsPtr1 基因过表达载体构建及水稻转化植株获得
• 2.7 转过表达OsPtr1 基因水稻植株southern blot 分析
• 2.8 稻米含氮代谢物质分析
• 3. 讨论
• 3.1 利用T-DNA 标签进行水稻胚乳发育相关突变体筛选
• 3.2 氮代谢及肽转运的机理
• 3.3 肽转运对胚乳发育的影响
• 第三章、Susiba2 和OsSusiba2 基因在水稻淀粉代谢调控中的功能分析
• 1、材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 载体及宿主菌
• 1.1.2 农杆菌介导转化受体
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 质粒转化、提取和转化子的鉴定
• 1.3.2 农杆菌介导法转化水稻
• 1.3.3 转基因水稻抗性植株筛选
• 1.3.4 转基因水稻Southern blot 检测
• 1.3.5 水稻转基因植株northern blot 分析
• 1.3.5.1 RNA 提取
• 1.3.5.2 溶液配制
• 1.3.5.3 样品制备和印迹
• 1.3.5.4 预杂交
• 1.3.5.5 标记
• 1.3.5.6 放射性物质的纯化
• 1.3.5.7 信号检测
• 1.3.6 稻米直链淀粉含量测定
• 1.3.7 转基因水稻植株产量性状的分析
• 1.3.8 转基因水稻植株碳水化合物的分配
• 1.3.9 糖诱导下转基因水稻的表达分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 Susiba2 和OsSusiba2 基因植物表达载体的构建
• 2.1.1 Susiba2 过表达植物表达载体的构建
• 2.1.2 OsSusiba2 基因反义RNA 植物表达载体的构建
• 2.1.3 OsSusiba2 基因RNAi 干扰植物表达载体的构建
• 2.2 农杆菌介导转化获得水稻转基因植株
• 2.3 转基因水稻植株southern blot 分析
• 2.4 转基因水稻northern blot 分析
• 2.5 糖诱导下转基因水稻的表达分析
• 2.6 转基因稻米直链淀粉含量分析
• 2.7 转基因水稻植株表型分析
• 2.8 转基因水稻的产量性状分析
• 2.9 转基因水稻碳水化合物分配
• 3、讨论
• 3.1 糖感知和信号传导在植物碳水化合物代谢中的作用
• 3.2 糖诱导下的淀粉代谢相关基因研究
• 3.3 水稻胚乳淀粉代谢调控研究
• 第四章、结论及创新点
• 主要参考文献
• 附录1：常用分子生物学实验方法
• 附录2：水稻启动子捕获系中在不同组织器官中GUS 活性表达
• 附录3：Tail-PCR 扩增程序及引物
• 附录4：Southern blot 杂交程序
• 附录5: PlantCare 预测OsPtr1 启动子的调控元件
• 附录6: OsPtr1-GFP 融合表达载体的构建
• 附录7：OsPtr1 基因过表达载体构建
• 附录8：OsSusiba2 和Susiba2 基因植物表达载体构建
• 附录9：水稻RNA 提取步骤
• 附录10：本研究所用基本培养基配方
• 致谢