论文题目: 棉花GA 20-氧化酶基因的克隆和功能分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 肖月华
导师: 裴炎
关键词: 棉花,纤维,赤霉素,氧化酶,基因工程
文献来源: 西南农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 棉花是世界上最重要的天然纤维作物,我国是重要的产棉大国和纺织品出口国,棉花在我国国民经济中占有重要的地位。作为工业原料作物,一个优良的棉花品种,不仅要产量高,而且纤维品质要好,方能实现其最终产品价值。因此,纤维的产量和品质一直是棉花育种的主要目标。基因工程技术为棉花育种提供了新的策略和广阔前景,但是目前尚未克隆与棉花纤维产量和品质直接相关的基因,纤维产量和品质的基因工程改良还缺乏有效的途径和目的基因。 赤霉素(Gibberellins,GA)是一类重要的植物激素,参与控制种子萌发、茎的伸长、叶片伸展、表皮毛发育、根的生长,以及花和果实的发育等多种多样的发育和生理过程。前人研究表明,GA在棉花纤维发育中有着重要的作用,与纤维产量和品质有着密切的关系。从分子生物学水平阐明GA及其合成酶基因与纤维发育和纤维品质的关系,可能为棉花纤维产量和品质的基因工程改良提供新的策略,具有非常重要的理论和实践意义。 为阐明赤霉素影响棉花纤维发育和品质的分子机理,本论文从棉花纤维中克隆了两个GA 20-氧化酶的同源基因(GhGA20oxl和GhGA20ox2),并进行了基因结构和表达分析。进一步将克隆的GA 20-氧化酶基因在烟草中超量表达,研究了克隆基因的生物功能。最后将GhGA20oxl基因的超量表达和反义抑制载体转化棉花,研究了GhGA20oxl基因的超量表达和反义抑制以及GA合成对在棉花生长发育的影响。另外,论文还克隆了两个棉花GA 20-氧化酶基因的5’-调控序列,并分析了其表达特性。 主要结果如下: 1.棉花GA 20-氧化酶基因的克隆 用拟南芥GA 20-氧化酶基因作探针序列,从棉花纤维EST库中筛选了一个同源序列。根据EST序列设计引物,扩增了相应的基因组序列,并用YADE(Y-shapedAdaptor Dependent Extension)方法扩增了该EST序列的5’-上游序列。序列分析表明,扩增的5’-上游序列包含了相应基因的翻译起始ATG。 根据起始ATG的上游序列设计引物,利用RACE方法从棉花纤维中扩增了两个GA 20-氧化酶的cDNA基因(GhGA20oxl和GhGA20ox2),进一步用YADE法延伸获得了两个基因的启动子和基因组序列。通过序列比较、同源性分析、分子杂交和RT-PCR等方法分析了两个GA 20-氧化酶基因的序列特征、表达特性等。 GhGA20oxl基因cDNA长1401bp,包含的最长ORF为1158bp,编码一个
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中文摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 棉花纤维发育的分子生物学研究进展
1.1.1 棉花概述
1.1.1.1 棉花的植物学分类
1.1.1.2 棉花纤维的发育过程
1.1.1.3 棉花纤维及其分子生物学研究的意义
1.1.2 纤维发育相关基因的克隆和功能分析
1.1.2.1 棉花纤维的基因表达分析
1.1.2.2 棉花纤维特异或优势表达基因的克隆
1.1.2.3 棉花纤维特异或优势表达基因的功能研究
1.1.3 棉花纤维发育的分子生理学研究
1.1.3.1 MYB基因与棉花纤维的分化起始
1.1.3.2 棉花纤维伸长的分子机理
1.1.3.3 棉花纤维次生壁合成的启动
1.1.3.4 棉花纤维的纤维素合成
1.2 植物激素在棉花纤维发育中的作用
1.2.1 赤霉素的分子生物学研究进展
1.2.1.1 植物赤霉素的代谢
1.2.1.2 赤霉素的信号传导
1.2.2 生长素生物合成酶基因与棉花纤维发育
第二章 引言
2.1 论文的立论依据
2.2 论文的技术路线
第三章 棉花GA 20-氧化酶基因的克隆及特征分析
3.1 材料
3.1.1 植物材料
3.1.2 菌株和载体
3.1.3 主要试剂
3.1.4 主要仪器设备
3.1.5 主要试剂和缓冲液配方
3.2 方法
3.2.1 RNA的提取
3.2.2 DNA的提取
3.2.3 EST序列的筛选和扩增
3.2.4 相邻序列的YADE扩增
3.2.5 cDNA序列的3′-RACE扩增
3.2.6 基因组序列的扩增
3.2.7 扩增产物的回收、克隆和序列测定
3.2.8 序列分析
3.2.9 RT-PCR分析
3.2.10 Northern分析
3.2.11 Southern分析
3.3 结果与分析
3.3.1 EST序列的筛选和扩增
3.3.2 g20EST相邻上游序列的YADE扩增
3.3.3 棉花GA 20-氧化酶cDNA基因的RACE扩增
3.3.4 GhGA20ox2基因的基因组序列的扩增
3.3.5 GhGA20ox1基因的基因组序列的扩增
3.3.5.1 GhGA20ox1基因5′-上游序列的YADE扩增
3.3.5.2 GhGA20ox1基因3′-下游序列的YADE扩增
3.3.6 GhGA20ox1和GhGA20ox2的基因组序列的克隆
3.3.7 棉花GA 20-氧化酶的氨基酸序列分析
3.3.8 棉花GA 20-氧化酶的同源性分析
3.3.8.1 棉花GA 20-氧化酶的同源蛋白查询
3.3.8.2 棉花GA 20-氧化酶及其同源蛋白的进化树分析
3.3.8.3 棉花GA 20-氧化酶及其同源蛋白的序列多重比较
3.3.9 棉花GA 20-氧化酶基因的基因组结构分析
3.3.10 棉花GA 20-氧化酶基因的表达分析
3.4 讨论
3.4.1 YADE方法的原理与应用
3.4.2 基因表达分析的方法
3.4.3 棉花GA 20-氧化酶基因家族
3.5 小结
第四章 棉花GA 20-氧化基因的启动子克隆及表达特性分析
4.1 材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 菌株和载体
4.1.3 主要试剂
4.1.4 主要缓冲液和培养基配方
4.2 方法
4.2.1 棉花GA 20-氧化酶基因的启动子克隆和序列分析
4.2.2 启动子表达载体构建
4.2.3 根癌农杆菌菌株LBA4404感受态的制备及DNA转化
4.2.4 质粒DNA的提取
4.2.5 烟草遗传转化
4.2.6 棉花遗传转化
4.2.7 转化烟草的PCR鉴定
4.2.8 转化植株的GUS表达特性分析
4.3 结果与分析
4.3.1 GhGA20ox1基因的启动子克隆
4.3.2 GhGA20ox2基因的启动子克隆
4.3.3 pGhGA20ox1和pGhGA20ox2的启动子序列分析
4.3.4 启动子表达特性分析载体构建
4.3.4.1 pGhGA20ox1的表达特性分析载体的构建
4.3.4.2 pGhGA20ox2的表达特性分析载体的构建
4.3.5 pGhGA20ox2在植物中的表达特性分析
4.3.5.1 pGhGA20ox2在烟草中的表达特性
4.3.5.2 pGhGA20ox2在棉花中的表达特性
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 棉花GA 20-氧化酶基因在烟草中的超量表达
5.1 材料
5.1.1 植物材料
5.1.2 菌株和载体
5.1.3 主要试剂
5.1.4 主要缓冲液和培养基配方
5.1.5 主要仪器设备
5.2 方法
5.2.1 超量表达载体的构建
5.2.2 烟草遗传转化及转化植株的鉴定
5.2.3 转基因表达分析
5.2.4 转基因烟草的性状变异分析
5.2.5 赤霉素含量的ELISA测定
5.2.5.1 激素的提取
5.2.5.2 样品测定
5.2.5.3 结果计算与分析
5.3 结果与分析
5.3.1 载体构建
5.3.1.1 GhGA20ox1超量表达载体的构建
5.3.1.2 GhGA20ox2超量表达载体的构建
5.3.2 GhGA20ox1基因在本明烟中的超量表达
5.3.2.1 本明烟的遗传转化
5.3.2.2 超量表达GhGA20ox1基因的本明烟的性状变化
5.3.2.3 超量表达GhGA20ox1基因对本明烟GA合成的影响
5.3.3 GhGA20ox1和GhGA20ox2在普通烟草中的超量表达
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 GhGA20ox1基因的棉花转基因功能分析
6.1 材料
6.1.1 植物材料
6.1.2 菌株和载体
6.1.3 主要试剂
6.1.4 主要缓冲液配方
6.1.5 主要仪器设备
6.2 方法
6.2.1 反义抑制载体的构建
6.2.2 棉花遗传转化
6.2.3 表达分析
6.2.4 性状分析
6.2.5 显微观察
6.2.5.1 材料的固定、脱水和包埋
6.2.5.2 切片、染色和观察
6.2.6 扫描电镜观察
6.3 结果与分析
6.3.1 反义抑制载体构建
6.3.2 棉花遗传转化
6.3.2.1 转基因棉花的获得
6.3.2.2 GA 20-氧化酶基因在转基因棉花叶片中的表达
6.3.3 GhGA20ox1基因的超量表达和反义抑制对棉花生长的影响
6.3.4 GhGA20ox1基因的超量表达和反义抑制对棉花花发育的影响
6.3.4.1 转基因棉花的花形态和花发育时间变化
6.3.4.2 转基因棉花的花药发育进程
6.3.5 GhGA20ox1基因的超量表达和反义抑制对棉花果实和种子发育的影响
6.3.6 GhGA20ox1基因的超量表达和反义抑制对棉花纤维的影响
6.3.6.1 转基因棉花纤维性状的变化
6.3.6.2 转基因棉花的纤维起始和早期伸长
6.4 讨论
6.4.1 GhGA20ox1的超量表达和反义抑制对棉花GA合成的影响
6.4.2 GA在棉花发育中的作用
6.4.2.1 GA对棉花开花结铃的影响
6.4.2.2 GA对棉花花粉发育的影响
6.4.2.3 GA对棉花纤维发育的影响
6.5 小结
第七章 结论
7.1 主要结论
7.1.1 棉花GA20-氧化酶基因GhGA20ox1的克隆和功能分析
7.1.2 棉花GA20-氧化酶同源基因GhGA20ox2的克隆和功能分析
7.1.3 GA对棉花发育的影响
7.1.4 启动子的克隆和功能分析
7.2 论文的创新
7.2.1 基因和启动子克隆
7.2.2 棉花GA的内源调控
参考文献
致谢
附录1 缩略词表
附录2 学习期间在GenBank上登录的基因序列
附录3 学习期间主持、参加的主要项目和发表的文章
1.主持和参加的主要项目
2.攻读博士学位期间发表论文情况
3.攻读博士学位期间专利申请情况
发布时间: 2005-07-19
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