ALKBH5加双氧酶细胞内定位及功能的初步研究

论文摘要

大肠杆菌由来的ALKB是最早发现的具有去甲基化功能的加双氧酶。依赖于铁离子和2-酮戊二酸的ALKB同源蛋白加双氧酶,对修复DNA毒性甲基化修饰,维持基因组稳定性和抑制细胞癌变起着至关重要的作用。人的基因组中已发现有9种ALKB同源基因（ALKBH1-8,FTO）,其中ALKBH1-3和FTO被证实具有去甲基化作用,ALKBH8与人类膀胱癌的发生相关,而ALKBH4-7功能研究至今几乎一片空白,本课题的研究目标即为研究ALKBH5基因的去甲基化活性与生物学功能。初期研究表明ALKBH5定位于细胞内核仁的纤维中心（FC）和致密纤维组分（DFC）,而且它与核糖体DNA结合并且抑制核糖体DNA的转录过程,以上现象可能与ALKBH5参与H3K4Me2/3的去甲基化过程有关。另外ALKBH5同时定位于核内speckle中,其在核仁和speckle定位均表现出对RNase A敏感,说明ALKBH5可能结合于核仁或speckle中的RNA,并且ALKBH5表达降低的细胞还会导致新合成的RNA水平明显升高。以上结果表明核仁和speckle中的ALKBH5可能对某些RNA去甲基化,进而调控相关的生命活动进程；尤其是为近来新兴的RNA甲基化表观遗传调控机理研究提供了新的线索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 引言
• 1.1 ALKB加双氧酶蛋白
• 1.2 核仁
• 1.2.1 核仁的形成
• 1.2.2 核仁的功能
• 1.3 表观遗传学
• 1.3.1 DNA甲基化
• 1.3.2 组蛋白甲基化
• 1.3.3 RNA甲基化
• 第二章 材料与方法
• 2.1 表达质粒的构建
• 2.2 蛋白质体外表达和纯化
• 2.3 Western杂交技术
• 2.4 用于质谱分析的蛋白样品制备
• 2.5 细胞培养
• 2.6 稳定细胞系的建立
• 2.7 免疫荧光技术
• 2.8 免疫共沉淀技术
• 2.9 利用小分子RNA干扰技术进行基因knockdown
• 2.10 RNase A敏感实验分析
• 2.11 细胞内新合成的RNA的变化测定
• 2.12 从293T细胞中提取核仁
• 第三章 研究结果
• 3.1 基于ALKBH5核仁定位的功能研究
• 3.1.1 ALKBH5蛋白去甲基化酶在细胞间期的核仁定位
• 3.1.2. ALKBH5与rDNA的结合作用
• 3.1.3. ALKBH5可能抑制核糖体DNA的转录过程
• 3.1.4 ALKBH5对组蛋白H3K4Me2和H3K4Me3有去甲基化作用
• 3.2 基于ALKBH5在speckle内定位的功能研究
• 3.2.1 ALKBH5定位于核内speckle
• 3.2.2 ALKBH5敲低导致新合成的RNA水平大量上升
• 3.2.3 ALKBH5蛋白去甲基化酶互作蛋白网络筛选和鉴定
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 致谢