拉莫三嗪对癫痫大鼠学习记忆及Bax、Bcl-2表达的影响

论文摘要

背景癫痫发作可导致继发性脑损伤,而海马是脑损伤最容易受累的部位。Bax和Bcl-2是脑损伤后细胞凋亡的诱导蛋白和凋亡抑制蛋白。流行病学调查及临床研究均证实发育阶段长期反复癫痫发作可损害学习、记忆等认知功能。目前癫痫发作的治疗主要是药物治疗,目前普遍认为传统抗癫痫药物（Anti epileptic Drugs,AEDs）对认知功能的影响较大,而对新型AEDs对认知功能的影响了解较少。拉莫三嗪（lamotrigine,LTG）是一种新型AEDs,其对癫痫发作后脑损伤的保护作用机制以及对患者认知功能的影响等方面的研究近年来一直是学者们关注的热点问题。目的通过观察LTG干预大鼠慢性癫痫模型发作情况和学习记忆的改变,检测其海马组织中Bax、Bcl-2蛋白表达情况,分析痫性发作过程中大鼠的行为和学习记忆是否与大鼠海马组织中Bax、Bcl-2蛋白表达水平有关、LTG的保护作用是否与海马中Bax、Bcl-2蛋白表达水平有关,大鼠的行为和学习记忆水平、海马组织中Bax、Bcl-2蛋白表达水平是否与LTG的剂量有关,为临床应用LTG及其剂量选择提供理论依据。方法选用6周健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠100只。随机分为正常组、模型组、LTG低剂量组、LTG中剂量组、LTG高剂量组,每组20只。每天每只大鼠腹腔注射戊四氮（Pentetrazole,PTZ）35mg/kg制备癫痫模型,正常组给予同体积生理盐水。观察其行为学变化30min。行为学判断按Racine分级法连续出现3次III级以上发作作为点燃标准。全部点燃后（约2周）,按LTG最大推荐剂量（600mg/d）的1/30、1/20、1/10分为低、中、高剂量组,即LTG低剂量组[20mg/（kg·d）]、中剂量组[30mg/（kg·d）]、高剂量组[60mg/（kg·d）];正常组和模型组予以等体积生理盐水。LTG与生理盐水配成所需浓度,大鼠给药容积1mL/100g,每天灌胃给药一次,共2周。造模第31天予以Morris水迷宫实验,连续5d,比较每组大鼠在迷宫测试中每日各时间点,第5天进行记忆与判断测验。各组大鼠水迷宫实验结束后,经心脏灌注固定取脑。通过HE染色了解其海马组织的病理学变化；采用免疫组织化学法观察其Bax、Bcl-2蛋白表达变化。各组数据以均数±标准差（x±s）表示,应用SPSS17.0软件包进行统计学分析,多样本均数的两两比较采用单因素方差分析,以P<0.05作为显著性检验标准。结果1.正常对照组无痫性发作；模型组有癫痫发作,发作潜伏期最短（1.70±0.79）min,但持续时间最长（6.38±2.20）min；低剂量组、中剂量组、高剂量组均有痫性发作,但发作级别降低,其中高剂量组潜伏期最长（6.81±1.86）min,持续时间最短（2.16±1.32）min；与模型组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组癫痫发作的潜伏期延长,发作级别降低；模型组与正常组癫痫发作潜伏期和持续时间比较差异有显著统计学意义（P<0.01）；低剂量组、中剂量组、高剂量组与模型组癫痫发作潜伏期和持续时间比较差异有统计学意义（P<0.05）;2. Morris水迷宫实验,大鼠定位航行实验结果显示：正常组、模型组、LTG低、中、高剂量组的第一天逃避潜伏期分别为（25.15±1.39） s、（60.08±1.17）s、（54.50±0.93） s、（37.93±1.23）s、（36.38±0.83） s。各组第二天的逃避潜伏期分别为（20.58±0.86） s、（61.22±1.64）s、（58.59±0.91） s、（30.70±0.95） s、（30.63±0.95） s。各组第三天的逃避潜伏期分别为（15.45±0.61） s、（59.59±0.63）s、（57.31±1.06） s、（30.47±0.57） s、（25.16±1.71）s。各组第四天的逃避潜伏期分别为（12.64±0.86） s、（55.62±0.40） s、（56.57±1.61）s、（27.69±0.82） s、（20.59±0.95） s。与正常组相比,模型组大鼠的逃避潜伏期明显增加;LTG低、中、高剂量组与模型组相比,逃避潜伏期明显缩短。空间探索实验结果显示：模型组记忆探索正确时间为（26.01±2.21）s,与正常组（4S.77±3.40）s比较差异有统计学意义（P<0.05）；大鼠120s内在原放有平台的象限内停留的时间,LTG低、中、高剂量组记忆探索正确时间分别为（27.85±1.05）s、（37.96±0.97）s、（39.82±1.34）s,与模型组相比明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。3.海马组织病理变化,模型组、LTG治疗组（低剂量组、中剂量组、高剂量组）海马CA1区小锥体细胞、CA3区大锥体细胞及DG区颗粒细胞排列较疏松杂乱,可见海马区细胞肿胀,边缘欠清晰,胞核、胞质深染,染色质边集凝集成块状,细胞空泡样变性,胞膜内陷,部分可见凋亡小体形成；且模型组较LTG各组严重,可见点片状坏死的细胞；正常组海马CA1区小锥体细胞、CA3区大锥体细胞及DG区颗粒细胞排列较整齐,可见海马区细胞完整,边缘清晰,胞核呈圆形、椭圆形,染色质核内分布均匀,核仁清晰,仅少许神经细胞空泡样变性,染色质边集,体积增大,细胞肿胀呈圆形；4.大鼠海马神经元免疫组化染色Bax、Bcl-2比较：正常对照组中Bax、Bcl-2蛋白染色阳性细胞低表达,其Bax和Bcl-2蛋白阳性表达分别为0.16±0.39、0.26±0.03；模型组Bax和Bcl-2蛋白阳性表达分别为0.35±0.05、0.27±0.03,和正常组比较Bax阳性细胞数增加,而Bc1-2阳性细胞数也增加；LTG低、中、高剂量组Bax蛋白阳性表达分别为0.29±0.45、0.24±0.04、0.20±0.05,LTG低、中、高剂量组Bcl-2蛋白阳性表达分别为0.33±0.28、0.36±0.04、0.38±0.02,与模型组比较有统计学意义（P<0.05）; LTG低、中、高剂量组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.在PTZ致痫性发作过程中,大鼠的行为和学习记忆能力可能与其海马区Bcl-2和Bax表达的变化有关。2.LTG可能增强致痫大鼠海马神经元Bcl-2的表达,降低Bax的表达,能减轻癫痫发作后海马神经元凋亡,对戊四氮致痫大鼠海马神经元有保护作用。3.在一定剂量范围内,LTG治疗组并无出现不良反应,对PTZ致痫大鼠抗凋亡作用随剂量的增加而作用增强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要器皿
• 1.1.4 器皿清洗
• 1.1.5 主要试剂
• 1.1.6 实验用液体的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 癫痫动物模型的建立及实验分组
• 1.2.2 Morris水迷宫测试
• 1.2.3 HE染色
• 1.2.4 免疫组织化学染色
• 1.2.5 图像分析
• 1.3 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 一般情况
• 2.2 造模结果
• 2.3 Morris水迷宫测试结果
• 2.4 海马组织HE染色结果
• 2.5 免疫组织化学染色结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述：常用新型抗癫痫药物对癫痫的认知损害的影响
• 参考文献
• 中英文缩略词对照表
• 攻读研究生期间发表论文
• 致谢
• 个人简历