双价抗真菌融合基因植物表达载体构建及转基因烟草的初步检测

论文摘要

真菌性病害和杂草危害是造成农作物产量大幅度下降及品质变劣的主要原因,严重影响着农业生产。在植物抗病基因工程中,通过将抗真菌蛋白基因和抗除草剂基因导入植物的方法来提高植物对真菌病害和除草剂的抵抗能力已成为一种直接而有效的途径。随着越来越多的抗真菌蛋白被发现,人们试图采用多基因共表达的策略将多种抗真菌蛋白基因转入植物,利用其协同作用以提高植物的抗病能力。但由于受到可选择的载体数目和载体容量的限制,这个目的很难较好的实现。融合基因技术和多价载体的构建是近几年出现的用于解决这一难题的有效途径。本研究通过木霉几丁质酶基因（CHI）和β-1,3-葡聚糖酶基因（GLU）的融合并将其连接到改造好的含有Bar基因的植物表达载体pBI121-Bar上构建双价植物表达载体pBI121-Bar/Chi-Glu,旨在提高作物抗真菌性病害的能力,同时降低在农业生产中除草所花费的大量人力和财力。主要结果如下:1.利用木霉几丁质酶基因（CHI）和β-1,3-葡聚糖酶基因（GLU）构建了融合基因。2.将Bar基因插入植物表达载体pBI121中,获得含有抗除草剂Bar基因的植物表达载体pBI121-Bar。3.构建了含有融合基因的植物表达载体pBI121-Bar/Chi-Glu,同时构建了两个单价（CHI和GLU）植物表达载体pBI121-Bar/Chi和pBI121-Bar/Glu。4.以烟草无菌苗叶片为受体,用农杆菌介导法将pBI121-Bar/Chi-Glu转入烟草中,以Bar基因作为选择标记,草丁膦（phosphinothricin,PPT）为选择剂进行筛选,获得了转基因植株。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 英文缩写符号及中英文对照表
• 1 前言
• 1.1 获得多价转基因植物的策略
• 1.1.1 多基因和多个表达载体构建策略
• 1.1.2 基因转化策略
• 1.1.3 问题与展望
• 1.2 融合基因研究进展
• 1.2.1 利用融合蛋白对目的基因进行示踪
• 1.2.2 利用融合基因增强目的基因的表达
• 1.2.3 利用融合蛋白改变目的蛋白的免疫原性
• 1.2.4 相同或相似功能的基因融合
• 1.3 植物抗真菌病害基因工程的策略
• 1.3.1 利用植物R基因
• 1.3.2 利用抗菌蛋白基因的策略
• 1.4 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因及其应用
• 1.4.1 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的特性
• 1.4.2 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的应用
• 1.5 Bar基因
• 1.6 农杆菌介导的遗传转化
• 1.6.1 转化机理
• 1.6.2 农柑菌介导的遗传转化方法
• 1.6.3 农柑菌介导的基因转移方法不足之初
• 1.7 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 技术路线
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 菌株与质粒
• 2.2.3 生化试剂和其它材料来源
• 2.2.4 PCR引物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 植物材料的种植
• 2.3.2 植物表达载体的构建
• 2.3.2.1 小量碱法提取质粒
• 2.3.2.2 PCR反应体系
• 2.3.2.3 PCR反应程序
• 2.3.2.4 目的片段的回收
• 2.3.2.5 目的片段与载体片段（Vector）的连接
• 2.3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.3.2.8 重组质粒的酶切鉴定体系
• 2.3.3 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备及转化
• 2.3.3.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.3.2 根癌农杆菌感受态细胞的转化
• 2.3.3.3 农杆菌Ti质粒DNA提取
• 2.3.4 利用农杆菌介导转化烟草
• 2.3.4.1 农杆菌培养
• 2.3.4.2 烟草转化、培养和植株再生
• 2.3.5 烟草再生植株的PCR检测
• 2.3.5.1 CTAB微量法提取基因组DNA
• 2.3.5.2 烟草再生植株的PCR筛选
• 3 结果与分析
• 3.1 Chi和Glu基因的亚克隆
• 3.1.1 Chi基因的亚克隆及测序
• 3.1.2 Glu基因的亚克隆及测序
• 3.2 中间载体的构建
• 3.2.1 中间载体pAHC25的改造
• 3.2.2 中间载体pAHC25-Chi和pAHC25-Glu的构建
• 3.2.3 植物表达载体pBI121的改造
• 3.2.4 植物表达载体pBI121-Ubi-Bar/Chi和pBI121-Ubi-Bar/Glu的构建
• 3.3 双价融合基因植物表达载体的构建过程
• 3.3.1 融合基因的构建过程
• 3.3.2 融合基因的PCR和酶切鉴定
• 3.3.3 融合基因的测序
• 3.3.4 双价植物表达载体的构建
• 3.4 植物表达载体质粒转化农杆菌
• 3.5 烟草再生植株的获得
• 3.6 烟草再生植株的PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 载体的容量方面
• 4.2 启动子的选择
• 4.3 植物抗病反应中抗真菌蛋白的协同效应
• 4.4 Bar基因
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介