心肌梗死基因治疗的实验研究

论文摘要

研究背景心肌梗死（myocardial infarction，MI）后左室重构是左室扩张和残余的非梗死心肌肥厚等因素的综合结果，其显著影响心肌梗死患者的心室功能和预后。心肌梗死后患者由心功能不全发展为心力衰竭的过程中，毛细血管床与肥厚心肌组织的比例结构失调可能发挥了重要作用。有研究报道，在非梗死区，微血管生长的速度和数量不足，导致肥厚心肌组织的毛细血管密度下降，由此继发氧气供应不足，心肌组织缺血，这将引起进行性的心肌细胞坏死、梗死区扩展和心肌纤维化。左室重构过程是决定心肌梗死患者预后的重要因素，因此各种旨在改善心肌梗死后左室重构的研究成为近年来研究的热点。诱导新血管生成已被证明是干预左室重构病理生理过程的有效手段。研究已经证明，某些药物、一些促血管生成因子以及干细胞治疗等均可有效诱导新血管生成，改善心肌梗死后左室重构和心功能。血管生长素（Angiogenin，ANG）是一个强效的促血管生长因子，而且是血管新生过程中必不可少的因子。体外实验证实，ANG促进内皮细胞的增殖、迁移，并在一定的培养条件下，形成管状结构；活体实验发现ANG可改善动物缺血肢体的血液供应；携带ANG的骨髓干细胞移植可促进缺血心肌血管生成、修复损伤心肌组织。然而，心肌内转染ANG基因对心肌梗死动物模型的影响目前尚未见报道。目的本研究构建携带目的基因ANG和报告基因lacZ的重组腺相关病毒载体（rAAV-ANG和rAAV-lacZ），建立心肌梗死大鼠模型，采用直接心肌内注射的方法，转染ANG基因，观察其在心肌组织的表达及其促血管生成作用、对心肌梗死大鼠左室重构和心功能的影响。方法按照AAV Helper-Free System试剂盒说明书，以pAAV-ANG（或pAAV-lacZ）、pAAV-RC和pHelper质粒磷酸钙共沉淀转染293细胞法包装rAAV-ANG和rAAV-lacZ病毒载体。成年雄性Wistar大鼠，随机分组：正常对照组（normal）、正常大鼠心肌内注射rAAV-ANG组（normal-rAAV-ANG）、假手术组（sham-operation）、心肌梗死大鼠心肌内注射生理盐水组（MI-saline）、心肌梗死大鼠心肌内注射rAAV-lacZ组（MI-rAAV-lacZ）和心肌梗死大鼠心肌内注射rAAV-ANG组（MI-rAAV-ANG）。以开胸结扎冠状动脉左前降支的方法建立心肌梗死模型。冠脉结扎后，立即取生理盐水、rAAV-lacZ或rAAV-ANG在梗死区周围4个点注射。4周后以超声心动图方法检测左室大小（左室舒张末期内径和左室收缩末期内径，即LVEDD和LVESD）和左室射血分数（LVEF），颈动脉插管测定有创左室血流动力学指标。大鼠处死后，测量左室重量，计算左室重量与体重比值。Western blot方法检测各组大鼠心肌组织ANG蛋白表达水平，免疫组化方法观察ANG蛋白在心肌组织的表达和分布。X-gal染色判断基因转染是否成功；免疫组化方法检测vWF表达以评价心肌组织毛细血管密度；组织学切片上测量非梗死区心肌细胞的横径和心肌间质纤维沉积指数。结果1．转染pAAV-LacZ的阳性对照293细胞和转染pAAV-ANG的293细胞48小时后出现细胞变圆、脱壁等表现，并且培养基逐渐变为橙黄色，说明有重组病毒产生。rAAV-ANG病毒颗粒不低于1012个/ml。重组病毒感染滴度为3×1010IU/ml。2．超声心动图和组织学检测证实，本研究成功建立了心肌梗死大鼠模型。大鼠心肌梗死面积在MI-saline、MI-rAAV-lacZ和MI-rAAV-ANG三组间相比无显著差异。3．MI-rAAV-lacZ组大鼠左室心肌组织X-gal染色显示大量心肌细胞胞浆蓝染，提示这些细胞成功转染并表达了lacZ基因。MI-rAAV-lacZ组大鼠的肝、肺、肾和脑组织切片行X-gal染色，未见阳性细胞。4．Normal、sham-operation、MI-saline和MI-rAAV-lacZ组大鼠左室心肌组织可以检测到低水平的ANG蛋白表达。与normal和sham-operation组相比，normal-rAAV-ANG组和MI-rAAV-ANG组大鼠左室心肌组织ANG水平显著升高；与MI-saline组相比，MI-rAAV-ANG组大鼠左室心肌组织ANG水平亦显著升高，提示在正常大鼠和心肌梗死大鼠心肌组织内局部注射的rAAV-ANG基因均能高效表达。免疫组化实验结果发现ANG蛋白在大鼠左室心肌细胞胞浆中弥散分布，在血管周围可见浓集。5．心肌梗死模型建立4周后，MI-saline和MI-rAAV-lacZ组心肌组织毛细血管密度显著低于normal和sham-operation组。正常大鼠转染rAAV-ANG后心肌组织毛细血管密度显著高于normal和sham-operation大鼠（P均＜0.05）。心肌梗死大鼠转染rAAV-ANG基因后心肌组织毛细血管密度显著高于MI-saline组（P＜0.05），与normal组无显著差异。6．与normal和sham-operation组相比，正常大鼠转染rAAV-ANG后左室腔大小、左室功能、左室重量、左室重量与体重比值、左室心肌细胞横径和心肌间质纤维沉积均无显著变化。7．与normal和sham-operation组相比，MI-saline组和MI-rAAV-lacZ组大鼠的左室重量显著增加，左室重量与体重比值亦显著增大。MI-rAAV-ANG组大鼠左室重量、左室重量与体重比值恢复至正常水平，与normal和sham-operation组相比无显著差异，与MI-saline组和MI-rAAV-lacZ组相比显著降低；超声心动图检测结果示，冠状动脉左前降支结扎4周后，与normal和sham-operation组相比，所有心肌梗死大鼠均表现出左室腔的扩大，rAAV-ANG治疗部分抑制、但未能完全阻止左室的扩大；MI-saline组和MI-rAAV-lacZ组大鼠心肌细胞横径显著大于normal和sham-operation组，而MI-rAAV-ANG组心肌细胞横径则与normal组无显著差异；与normal和sham-operation大鼠相比，MI-saline组和MI-rAAV-lacZ组大鼠心肌间质出现大量的纤维沉积。rAAV-ANG治疗显著抑制了心肌组织纤维化，MI-rAAV-ANG组大鼠心肌组织纤维沉积百分比显著低于MI-saline组，且与normal组无显著差别。8．与normal和sham-operation组相比，所有心肌梗死大鼠（MI-saline、MI-rAAV-lacZ和MI-rAAV-ANG 3个组）均表现出显著降低的LVEF、LVSP和±dp/dtmax，以及显著升高的LVEDP，表明其左室收缩和舒张功能均显著降低。与MI-saline和MI-rAAV-lacZ组相比，MI-rAAV-ANG组左室LVEF、LVSP和±dp/dtmax显著提高，同时LVEDP降低，提示rAAV-ANG转染显著改善了左室功能。结论1．结扎冠状动脉左前降支4周后，大鼠出现显著的左室重构，包括左室重量增加、左室腔扩大、非梗死区心肌细胞横径增加和心肌间质纤维沉积增多，伴有毛细血管密度下降。同时，心肌梗死大鼠的左室功能显著下降。2．正常大鼠心肌内注射rAAV-ANG载体后，心肌组织ANG蛋白表达增加，毛细血管密度增加，但心功能和左室重构指标无显著变化。3．心肌梗死大鼠心肌内注射rAAV-ANG载体后，心肌组织ANG蛋白表达增加，非梗死区毛细血管密度恢复正常，左室重构减轻（左室重量、左室内径、非梗死区心肌细胞横径和间质纤维沉积完全或部分恢复），同时，心功能明显改善。重组腺相关病毒介导反义磷酸受纳蛋白基因转染改善心肌梗死大鼠心肌肌浆网钙ATP酶活性和心功能的实验研究研究背景 近年来，内科药物、介入性治疗技术和外科手术的发展使冠心病患者的死亡率显著下降，但心肌梗死（MI）后心力衰竭仍是冠心病患者住院率和死亡率居高不下的重要因素。心力衰竭与心脏收缩舒张过程中细胞内钙离子转运异常关系密切，主要表现为静息状态下心肌细胞内钙离子浓度升高，转运速度减慢。而心肌细胞肌浆网钙ATP酶（SERCA）活性降低是钙离子转运异常的直接原因。SERCA的活性主要由磷酸受纳蛋白（PLB）调节，PLB／SERCA的相互协调作用决定了肌浆网内外钙离子转运进而决定了心肌收缩力。通过增加心肌细胞SERCA的表达及其活性，或者抑制PLB的表达，恢复PLB／SERCA的正常比例关系，对提高心肌收缩力至关重要。通过基因转染的方法增加SERCA蛋白表达显著恢复体外培养的人衰竭心肌细胞钙离子转运和收缩力。在体外培养的人衰竭心肌细胞和肥厚型心肌病动物模型中，也已经证实抑制PLB表达可以改善心肌的收缩舒张功能。在心肌梗死后显著心力衰竭的大鼠，冠脉内转染突变型PLB基因显著改善大鼠心功能和心室重构。然而，以直接心肌内注射方法转染反义磷酸受纳蛋白（asPLB）基因对于MI大鼠心肌SERCA活性和心功能的影响目前尚未见报道。SERCA活性降低除与PLB蛋白表达量密切相关外，还与PLB的磷酸化状态有关。非磷酸化的PLB抑制SERCA活性，而磷酸化的PLB增强SERCA的活性。PLB有两个主要的磷酸化位点：通过β-肾上腺素受体通路磷酸化Serine16残基；通过钙／钙调蛋白激酶II途径磷酸化Threonine17残基。既往的研究已经证实，大鼠衰竭心肌Serine16位PLB磷酸化（Pser16-PLB）减少，这是SERCA活性降低的主要原因。然而，asPLB治疗对大鼠心肌Pser16-PLB水平的影响尚未见报道。目的 本研究构建携带目的基因asPLB和报告基因lacZ的重组腺相关病毒载体（rAAV-asPLB和rAAV-lacZ），建立MI大鼠模型，采用直接心肌内注射的方法，转染asPLB基因，观察其对MI大鼠心肌组织PLB表达、Pser16-PLB水平、SERCA蛋白表达水平及其活性和心功能的影响。方法 按照AAV Helper-Free System试剂盒说明书，以pAAV-asPLB（或pAAV-lacZ）、pAAV-RC和pHelper质粒磷酸钙共沉淀转染293细胞法包装rAAV-asPLB和rAAV-IacZ病毒载体。成年雄性Wistar大鼠，随机分组：正常对照组（normal）、正常大鼠心肌内注射rAAV-asPLB组（normal-rAAV-asPLB）、假手术组（sham-operation）、心肌梗死大鼠心肌内注射生理盐水组（MI-saline）、心肌梗死大鼠心肌内注射rAAV-IacZ组（MI-rAAV-IacZ）和心肌梗死大鼠心肌内注射rAAV-asPLB组（MI-rAAV-asPLB）。以开胸结扎冠状动脉左前降支的方法建立心肌梗死模型。冠脉结扎完成后，立即取生理盐水或rAAV-lacZ或rAAV-asPLB在梗死区周围4个点注射。4周后超声心动图测定左室大小和左室射血分数（LVEF），颈动脉插管测定有创左室血流动力学指标。大鼠处死后，测定左室心肌组织SERCA活性，Westem blot方法检测各组大鼠心肌组织SERCA蛋白表达水平、PLB蛋白表达水平、Pser16-PLB水平。X-gal染色判断基因转染是否成功。结果1．与假手术组相比，结扎冠状动脉左前降支4周后，MI-saline组和 MI-rAAV-lacZ组大鼠出现显著的左室扩大和左心衰竭，表现为LVEDD和 LVESD增加，LVEF、LVSP、±dp／dtmax显著下降，LVEDP显著升高。与假 手术组大鼠相比，MI大鼠心肌组织PLB表达增加，Pser16-PLB水平下降， SERCA活性降低。2．与假手术组相比，normal-rAAV-asPLB组大鼠左室内径大小和左室功能无明 显变化，心肌组织PLB表达有所下降但未达到统计学差异，Pser16-PLB水 平、SERCA活性、SERCA蛋白表达水平均无显著变化。3． 与假手术组相比，MI-rAAV-asPLB组大鼠心功能未能完全恢复正常，但与 MI-saline组相比有明显改善，表现为LVEF、LVSP、±dp／dtmax显著升高， LVEDP显著降低。rAAV-asPLB治疗对左室内腔大小的改善并不明显，虽然 LVESD恢复至假手术组水平，但LVEDD却无明显改善。4． 与MI-saline组相比，MI-rAAV-asPLB组大鼠心肌组织PLB表达水平下降， PLB磷酸化水平和SERCA活性恢复。5． 心肌组织SERCA蛋白表达水平在各实验组间均无显著差异。结论1．结扎冠状动脉左前降支4周后，大鼠出现显著的左心室扩大和左心衰竭，同 时，左室心肌组织PLB蛋白表达量上调，Pser16-PLB水平下降，SERCA活 性下降。2．心肌内注射方式转染rAAV-asPLB基因对正常大鼠左室大小、心功能、心肌 组织Pser16-PLB水平、SERCA活性、SERCA蛋白表达水平均无显著影响。3．心肌内注射方式转染rAAV-asPLB基因显著改善MI大鼠心功能，该治疗显 著抑制心肌组织PLB蛋白表达，恢复PLB在Ser16残基的磷酸化水平，从 而恢复心肌细胞SERCA活性，对SERCA蛋白表达水平无显著影响。糖尿病大鼠心肌磷酸受纳蛋白基因表达和肌浆网 研究背景 糖尿病性心肌病是糖尿病（DM）最重要的并发症之一。在其发生发展过程中，心肌细胞的基因表达可能发生的异常改变目前尚不清楚。心肌细胞的收缩（PLB）的调控。既往的研究表明，在特发性扩张型心肌病患者，PLB-SERCA的相互关系失调是心肌细胞钙离子转运异常的关键环节。活体实验证实，PLB蛋白的过度表达抑制心肌细胞肌浆网钙离子转运能力，导致收缩期心肌细胞内钙离子浓度降低，代表心肌细胞收缩能力的各项指标降低，从而左心室的整体收缩功能下降。在糖尿病大鼠模型，心肌肌浆网蛋白表达异常与左心室收缩功能异常密切相关，而胰岛素治疗可恢复心肌肌浆网蛋白表达和左心室收缩功能。体外实验证实，糖尿病大鼠心肌细胞的收缩和舒张功能均显著下降，并与肌浆网对钙离子的摄取和释放异常密切相关。已有研究者在整体水平观察糖尿病大鼠心肌组织钙离子转运蛋白表达的异常改变，但得出的结果却不一致。目的 本研究建立DM大鼠模型，分别于4、6、8周后观察DM大鼠心肌PLB基因表达、SERCA蛋白水平和活性的变化及其与心功能的关系。方法 成年雄性Wistar大鼠，称重后按照剂量65mg／kg腹腔内注射链脲佐菌素（以柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制）溶液；正常对照组大鼠称重后，腹腔注射柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。7天后，测定血糖浓度大于16．7 mmol/L、尿糖持续阳性者为成功制成的糖尿病大鼠模型。分别在4、6、8周时对糖尿病组和对照组大鼠进行左心室血流动力学检测以评估左心室功能，以RT-PCR方法测定心肌PLB mRNA转录水平，以Western blot方法检测心肌PLB蛋白和SERCA蛋白表达水平，并测定心肌SERCA活性。结果1 与正常对照组相比，糖尿病大鼠在4周时，心肌SERCA蛋白水平无明显变化； 6周和8周时，心肌SERCA蛋白表达水平呈现下降趋势，但未达统计学显著性 意义。2 4周糖尿病大鼠的心肌SERCA活性与正常组大鼠相比无明显差异；6周和8周 糖尿病大鼠心肌SERCA活性显著低于正常对照组。3 4周糖尿病大鼠与正常组大鼠相比，PLB mRNA水平和蛋白表达水平无明显 差异：6周和8周糖尿病大鼠的PLB mRNA水平和蛋白表达水平均显著高于正 常组大鼠；而在6周和8周糖尿病大鼠两组问无明显差异。4与正常对照组相比，4周糖尿病大鼠的LVSP、LVEDP和：±dp／dtmax无明显变化； 6周和8周糖尿病大鼠的LVEDP明显升高，LVSP、±dp／dtmax均明显降低。结论糖尿病大鼠6周和8周时心肌PLB mRNA和蛋白表达水平升高，SERCA蛋白表达无明显变化，SERCA活性降低，同时左心室功能显著下降。

论文目录

• 第一部分
• 主要缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 本研究的创新之处
• 本研究的不足之处
• 参考文献
• 第二部分
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 本研究的局限性
• 结论
• 参考文献
• 第三部分
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 文献综述（一）
• 文献综述（二）
• 附录
• 博士在读期间发表的文章
• 博士在读期间参与科研项目
• 致谢