论文题目: 水稻开花基因的克隆和功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 王艳红
导师: 王辉,刘耀光
关键词: 水稻,抑制缩减杂交,过量表达,开花
文献来源: 西北农林科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 水稻是三大主要粮食作物之一,对其生长发育相关功能基因的研究具有重要的理论和应用意义。在水稻从营养生长向生殖生长转换过程中涉及了一系列的关键基因。本实验主要以1个早熟粳稻品种石狩白茅为材料,利用抑制缩减杂交文库克隆了多个营养生长到生殖生长转换过程中差异表达的基因。另外,对3个可能与生殖发育相关的基因的功能进行了研究,以期阐明水稻开花的分子机理。实验主要取得了以下研究结果: 1.利用抑制缩减杂交的方法,建立了水稻从营养生长向生殖发育转换过程茎尖组织的上调表达(以生殖转换后RNA为Tester)和下调表达(以营养生长期RNA为Tester)缩减cDNA文库。 2. 经过点杂交和反向Northern杂交验证,以及进一步酶切分析归类,从上调表达文库中共得到16 个差异表达克隆,从下调表达文库中得到17 个差异表达的克隆。 3.对这些差异表达基因克隆的测序结果表明,大多数基因涉及不同的代谢途径,有2 个基因编码转录因子。 4.对这些基因用Northern杂交分析表明,表达量较高能检测到杂交信号的基因有5 个,所占的比例为25%。 其它28 个基因用实时定量PCR 分析,结果表明在营养生长向生殖生长转换过程中有上调或下调表达差异。 5.为研究3 个水稻的生殖发育相关的基因OsEMF2-1, OsEMF2-2, OsFCA 的功能,构建了RNA干涉载体,另外构建了OsEMF2-1 的Ubi启动子超表达载体,转化石狩白茅。 6.用RT-PCR 研究了这3 个基因的表达特性,表明这三个基因都在穗部表达,而在根中没有表达。 7.在分子水平对于转化植株进行鉴定,结果表明转化是成功的,T-DNA插入以单位点插入为主。 8.OsEMF2-1 超表达的转化植株大部分没有Northern杂交信号产生,说明尽管使用强启动子控制其转录,其mRNA的积累被控制在一个低水平。但1 个转化植株产生了2 条长于转基因预期长度的强杂交带。RT-PCR 检测证明这2 条转录本是导入的OsEMF2-1 的转录过程中在Nos 位点发生通读产生的,其高水平积累说明该转录本3’
论文目录:
目录
摘要
缩略词与英汉对照
第一章 文献综述
一: 植物功能基因研究方法
1.1 序列克隆法
1.2 功能克隆法
1.3 转座子或T-DNA标签法
1.4 消减杂交法
1.5 差异表达分析法
1.6 基因功能敲除法
1.6.1 反义技术
1.6.2 基因剔除和转基因技术
1.7 RNA干涉技术
1.7.1 RNAi的研究进展
1.7.2 RNAi的特征
1.7.3 RNAi分子机制的研究进展
1.7.4 与RNAi相关基因的克隆
1.7.5 RNA干涉的作用特点
1.7.6 RNA介导同源DNA甲基化(RdDM)
1.7.7 各种小RNA的特征
1.8 荧光定量PCR
1.8.1 SyberGreenI标记法
1.8.2 TaqMAN技术
1.8.3 Molecular beacon分子信标
1.9 基因芯片技术
二: 植物开花基因研究进展
第二章 利用抑制缩减杂交研究和分离水稻开花相关基因
2.1 引言
2.2 材料
2.2.1 供试的水稻材料
2.2.2 主要试剂
2.2.3 载体和菌株
2.2.4 主要设备
2.2.5 主要试剂配方
2.2.6 改良的SSH实验流程
2.2.7 实验中所涉及的引物
2.3 实验方法
2.3.1 生长点的鉴定和取材
2.3.2 cDNA的获得
2.3.3 cDNA的酶切和接头的连接
2.3.4 抑制缩减杂交
2.3.5 两轮抑制PCR扩增
2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.3.7 差异片段的TA连接
2.3.8 重组子的鉴定和保存
2.3.9 高密度膜的制备
2.3.10 缩减cDNA文库的筛选
2.3.11 反向Northern杂交
2.3.12DNA序列测定和分析
2.3.13 Northern杂交
2.3.14 实时荧光定量PCR
2.3.15 分析软件或工具
2.4 结果与分析
2.4.1 抑制缩减杂交研究的总策略
2.4.2 RT-PCR以及两轮抑制PCR
2.4.3 用TA连接克隆抑制PCR产物
2.4.4 缩减cDNA文库构建和筛选
2.4.5 反向Nothern杂交
2.4.6 序列的测定
2.4.7 部分基因的Northern杂交和定量PCR
2.5 讨论
2.5.1 SSH方法探讨
2.5.2 水稻开花成穗基因的筛选特点
2.6 结论
第三章 几个水稻开花基因的功能研究
3.1 引言
3.2 材料
3.2.1 石狩白茅,中花11
3.2.2 各种培养基的配方
3.2.3 植物激素母液
3.2.4 植物DNA抽提所需溶液
3.2.5 植物微量DNA抽提液
3.3 实验方法
3.3.1 目标基因的选取
3.3.2 基因片段的获得
3.3.3 超表达片段的获得
3.3.4 PCR扩增反应
3.3.5 细菌的培养
3.3.6 碱裂解法抽提质粒DNA
3.3.7 质粒酶切及纯化
3.3.8 干涉及超表达载体的构建
3.3.9 DNA片段的回收
3.3.10 DNA的连接
3.3.11 大肠杆菌感受态细胞制备及转化
3.3.12 装载质粒的酶切检测
3.3.13 农杆菌感受态细胞制备及转化
3.3.14 农杆菌转化子的检测鉴定
3.3.15 农杆菌的活化及悬浮
3.3.16 水稻愈伤组织的诱导及继代
3.3.17 愈伤组织的浸染及共培养
3.3.18 抗性愈伤组织的筛选、预分化及分化
3.3.19 幼苗的生根壮苗及移栽
3.4 转化植株的分子检测
3.4.1 采用CTAB法抽提转化植株总基因组DNA
3.4.2 转化植株HPT的PCR检测
3.4.3 HPT以及转化基因的Southern杂交检测
3.4.4 RNA水平上的分子检测
3.4.5 目标基因及HPT的Northern杂交
3.4.6 实验中所涉及的引物
3.4.7 TAIL-PCR所需引物、程序以及反应体系
3.5 结果与分析
3.5.1 干涉片段从基因组中扩增
3.5.2 OsEMF2-1的全长cDNA从反转录产物中扩增
3.5.3 干涉质粒在农杆菌的稳定性检测
3.5.4 农杆菌介导的水稻转化
3.6 转化植株T0代的表型
3.6.1 转化植株T0代植株统计
3.6.2 OsEMF2-1RNA干涉和超表达后转化植株T0代表型
3.7 转化植株的分子检测
3.7.1 选择标记HPT的扩增检测
3.7.1 基因组水平上的HPT和目标基因的Southern杂交检测
3.7.3 目标基因的时空表达模式
3.7.4 干涉转化植株的RNA水平检测
3.7.5 超表达转化植株的RNA水平检测
3.7.6 一个超表达转化体的T-DNA插入位置的确定
3.8 讨论
3.9 进一步研究的设想
3.10 结论
本文总结
本研究的创新点
致谢
参考文献
附录
作者简介
发布时间: 2005-12-22
参考文献
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