利用固定化真菌Rhizopus sp.LG04连续还原Cr（Ⅵ）的研究

论文摘要

由于铬及其化合物在工业领域的广泛使用,使其大量地以气体、液体和固体的形式进入环境中,产生了严重的生态环境和健康问题。在铬污染废水中,Cr（VI）的毒性最强,约为Cr（III）的100倍,且最难去除。因此,将可溶的Cr（VI）还原为毒性较低的Cr（III）,是现阶段治理铬污染废水的有效方法之一。由于有些微生物具有吸附或还原Cr（VI）的能力,且在自然界中含量丰富易于分离培养,使它们在铬污染的治理中具有很大的潜力,越来越受到人们的广泛关注。其中,细菌除铬的研究主要集中在对Cr（VI）的还原方面,真菌主要是综合对Cr（VI）的吸附和还原两个方面来达到治理铬污染的目的,其研究没有细菌的深入。本课题从湖北大冶铁山矿等的污染土壤中筛选出30株Cr（VI）还原真菌和10株Cr（VI）还原细菌,并利用形态学及ITS （Internal Transcribed Spacers）,18S rRNA,16S rRNA基因序列等方法,对它们进行初步分类鉴定。利用菌株在含Cr（Ⅵ）培养基中的生长,对菌株的Cr（VI）还原效果进行了测定。其中真菌菌株Trichophyton sp. LG12, Trichophyton sp. LG14, Trichoderma sp. LG15, Hypocrea sp. LG16, Trichoderma sp. LG17, Colletotrichum sp. LG21在含Cr（VI）初始浓度为0.8 mM的改良马丁培养基中生长3天时,对Cr（VI）的还原效率均可达到90%以上,细菌菌株Streptomyces sp. LG37在含Cr（VI）初始浓度为2 mM的TSBY培养基中生长28 h时对Cr（VI）的还原效率可达到100%,细菌Streptomyces scabiei sp. HS5在含Cr（VI）初始浓度为0.8 mM的TSBY培养基中生长24 h时对Cr（VI）的还原效率可达到100%。另一株真菌Rhizopus sp. LG04虽然对Cr（VI）的还原效率比上述菌株稍低（70.78%）,但菌丝体和孢子发达。因此,将上述9菌株作为本课题固定化除铬研究的重点菌种资源,并对它们进行固定化除铬的固定化包埋试验。结果发现菌株Rhizopus sp. LG04孢子的包埋固定化小球在稳定性上为最好,其余菌株菌体均易从包埋固定化小球中泄漏。本研究重点对游离真菌LG04还原Cr（VI）和固定化LG04孢子小球连续还原Cr（VI）及其还原机制进行了研究。经过形态学及ITS和18S rRNA基因序列分析,该菌株被确定为根霉菌（Rhizopus）,编号为Rhizopus sp. LG04。LG04菌株具有10mM的Cr（VI）抗性,在好养条件下生长并进行Cr（VI）的还原。游离的Rhizopus sp.LG04在改良马丁培养基中生长4.5天可将0.8 mM的Cr（VI）完全还原。通过扫描电镜、能谱扫描和透射电镜等方法对LG04还原Cr（VI）的机制进行的初步研究,发现菌株LG04对Cr（VI）的还原机制可能包括两部分：第一,LG04菌体可能分泌-种或几种还原性物质（可能包括酶类）到菌体细胞外,参与对Cr（VI）的还原；第二,菌体表面的官能团吸附并将Cr（VI）还原为Cr（III）,然后将Cr（III）释放到水体环境中。其中第一个方面在Cr（VI）的去除中起主要作用。为了将Rhizopus sp. LG04的除铬能力应用于含铬污水的治理中,对菌体的包埋固定化材料及比例进行了多次试验,最终得到了利用3%聚乙烯醇（PVA, w/v）和3%海藻酸钠（SA, w/v）的包埋剂制备而成的LG04固定化小球在50%改良马丁培养基中连续还原Cr（VI）的体系。固定化的Rhizopus sp. LG04小球在不补充营养条件的50%改良马丁培养基中,可连续4次将0.8 mM的Cr（VI）持续还原,还原效率依次为100%,98.11%,85.68%和72.5%。在更换新鲜含0.8 mM Cr（VI）的50%改良马丁培养基条件下,固定化的Rhizopus sp. LG04小球可重复利用,进行高达30个循环以上的Cr（VI）还原,第一个循环在第5天时可将Cr（VI）彻底还原,随着循环次数的增加,Cr（VI）还原速率也逐渐增加,从第15个循环开始,每次还原添加的0.8 mMCr（VI）仅用2.5天。在第19、22、27、30次循环的开始和结束时测得溶液的pH值从6.5-6.7下降到了3.7-4.0。pH值的降低,可能是LG04对Cr（VI）的还原所致,而酸性环境进一步增强了菌体表面质子化的官能团捕获Cr（VI）阴离子的能力。通过扫描电镜和光学显微镜观察证实了LG04孢子可以在固定化小球中萌发生长,这也是固定化LG04小球能够持续还原Cr（VI）的基础。另外,本研究采用的3%PVA和3%SA的包埋剂组合,不仅固定化材料组成简单、廉价、无毒,固定化小球单位体积内包埋的生物量更大,固定化牢固,重复利用性好,而且固定化Rhizopus sp. LG04小球具有良好的机械强度和化学稳定性,这都为它的持续循环利用提供了有力的前提条件,预示了其在实际中巨大的应用潜力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略名词表（ABBREVIATIONS）
• 1 前言
• 1.1 铬污染及危害
• 1.2 铬污染的传统处理方法
• 1.3 生物法处理铬污水及机制的研究
• 1.4 固定化微生物除CR（Ⅵ）的研究
• 1.4.1 微生物固定化的方法
• 1.4.2 固定化微生物除铬的研究
• 1.5 研究目的与技术路线
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 实验培养基及组分
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Cr（Ⅵ）还原菌的筛选
• 2.2.2 Cr（Ⅵ）还原菌的分类鉴定
• 2.2.2.1 扩增ITS、18S rRNA和16S rRNA基因
• 2.2.2.2 菌株LG04的形态学观察
• 2.2.3 分离菌株对Cr（Ⅵ）还原效率的测定
• 2.2.4 Cr（Ⅵ）对LG04菌丝体的影响
• 2.2.4.1 扫描电镜-能谱扫描观察
• 2.2.4.2 透射电镜观察
• 2.2.5 LG04固定化小球对Cr（Ⅵ）还原效率的测定
• 2.2.5.1 LG04孢子的固定化
• 2.2.5.2 固定化小球对Cr（Ⅵ）还原效率的测定
• 2.2.6 LG04固定化小球的重复使用效率的测定
• 2.2.7 LG04固定化小球处理含Cr（Ⅵ）培养基前后的变化
• 2.2.7.1 肉眼观察
• 2.2.7.2 光学显微镜观察
• 2.2.7.3 扫描电镜观察
• 3 结果与分析
• 3.1 CR（Ⅵ）还原菌的筛选及初步鉴定
• 3.2 菌株RHIZOPUS SP.LG04的分类鉴定
• 3.2.1 菌落形态的观察
• 3.2.2 菌丝、孢子囊及孢子形态的观察
• 3.2.3 ITS和18S rRNA基因鉴定
• 3.3 游离菌株LG04对CR（Ⅵ）的还原效率
• 3.4 真菌LG04在还原CR（Ⅵ）过程中菌丝体的变化
• 3.5 LG04固定化抱子对Cr（Ⅵ）的还原
• 3.6 LG04固定化小球的重复使用效率
• 3.7 LG04固定化小球处理含CR（Ⅵ）培养基前后的变化
• 3.7.1 肉眼观察
• 3.7.2 电镜观察
• 4 讨论
• 5 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录