论文摘要
HBV转录后调节序列（HPRE）是乙肝病毒（HBV）基因组中在转录后水平调节HBV基因表达的调控序列，广泛存在的细胞核因子即HPRE结合蛋白与该序列结合能促进mRNA向细胞核外转移，从而促进病毒基因的复制和表达，同时，由某些细胞因子诱导产生的HPRE抑制性结合蛋白与该序列某些位置结合，抑制此环节，从而阻碍病毒基因的复制和表达。猪囊虫是猪带绦虫的幼虫，在人体内寄生可引起囊虫病。有关猪囊虫病疫苗的研制有许多方法，包括虫体来源的天然抗原或重组抗原，蛋白亚单位疫苗，以及核酸疫苗。90年代发展起来的核酸疫苗具有能够激发机体全面免疫发应、不散毒、便于储存和运输等优点，具有潜在的应用价值，但其潜在的危险性也是关注的焦点。已有研究证明以猪囊虫共同抗原基因制备的核酸疫苗具有良好的保护率。本研究首先以荧光素酶（luciferase，LUC）基因为报告基因，将HBV转录后调节序列（HPRE）以及缺失不同功能区域的HPRE片段插入报告基因下游，构建以下真核表达质粒：pcDNA3.0-luc、pcDNA3.0-luc-HPRE、pcDNA3.0-luc-HPREβ1β2、pcDNA3.0-luc-HPREαβ2及pcDNA3.0-luc-HPREαβ1，转染真核细胞，以重组人IFN-α作为诱导产生HPRE抑制性结合蛋白的刺激因子，在IFN-α作用前后，荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性的变化。发现缺失功能区域β2后，IFN-α作用前后的荧光素酶活性变化不明显，说明HPRE抑制性结合蛋白主要与β2发生作用。搞清楚HPRE抑制性结核蛋白结合区域后，将不含此区域的HPRE片段插入猪囊虫核酸疫苗pPCV中，构建核酸疫苗pPCV-HP，免疫小鼠，测抗体滴度，并于两周后用猪绦虫卵攻击，三个月后解剖观察猪囊尾蚴数，结果显示核酸疫苗pPCV-HP的抗体滴度高于核酸疫苗pPCV，其保护率也比核酸疫苗pPCV的保护率高8％。采集猪各组织和猪舍环境中的粪便及土壤样品，提取各组织的总DNA和卡那抗性菌的质粒，PCR系统检测质粒在各组织的分布、与宿主细胞基因组整合情况和转化环境细菌的可能性。结果发现疫苗质粒在注射部位以外的组织中很快被清除，在注射部位组织也未检测到整合现象，扩散和转化环境细菌的可能性也极小。说明新构建的核酸疫苗pPCV-HP不仅增强了免疫保护作用，而且具有较高的生物安全性。