西尼罗病毒核酸及抗体检测体系的建立与评价

论文摘要

西尼罗病毒（West Nile virus,WNV）是黄病毒科黄病毒属成员,最早于1937年于乌干达一位发热妇女的血液中分离到。西尼罗病毒引起的西尼罗脑炎和西尼罗热是严重影响人类及动物健康的传染病。WNV以往仅在非洲、西亚、中东地区流行,60年代初传入欧洲,自1999年起在西半球登陆,并相继在美国传播。美国CDC报道了美国2007年前半年WNV感染的情况,共有19个州的122人感染了WNV。WNV也可通过输血及器官移植传播。WNV的流行对人类及动物健康产生巨大的威胁。目前尚无针对WNV的特效治疗药物,亦无有效的疫苗预防WNV感染。我国目前还未见人感染WNV的病例和在动物体内发现WNV的报道。由于野生鸟类是其自然宿主,携带病毒的候鸟可能导致病毒在不同地区之间的传播,随着候鸟的迁徙及我国与世界其他国家之间的贸易、旅游、人员往来日益频繁,WNV通过各种途径传入我国的可能性很大。为有效应对我国可能发生的WNV的暴发流行,有必要开展对WNV检测方法的研究。本研究首先通过选取WNV较保守的衣壳蛋白基因区作为目的扩增片段,建立WNV荧光定量检测体系,同时对检测体系进行了方法学评价。对西尼罗病毒囊膜蛋白基因进行分析确定其抗原决定簇区域并克隆该囊膜蛋白结构域Ⅲ基因,进而通过基因重组技术获得病毒囊膜蛋白结构域Ⅲ抗原。基于表达的结构域Ⅲ抗原建立WNV抗体检测体系并对建立的检测体系进行了相应的方法学评价。WNV核酸及抗体检测体系的建立对于我国人与动物的WNV感染监控、人类输血安全以及技术储备等均具有重要的意义。主要分以下三个方面进行介绍。1.WNV核酸检测体系的建立及评价本研究建立了一种实时荧光定量PCR快速检测西尼罗病毒的方法。通过序列比对和blast分析,确定WNV衣壳蛋白保守区基因为检测的目的基因,引物采用Primer Premier5.0软件进行设计。本研究建立的检测方法利用SYBRGreenⅠ染料,相比探针法成本较低。通过熔解曲线分析表明,建立的检测方法在扩增过程中没有发现有二聚体的产生。本检测体系在用空白对照及类似的乙脑病毒作为扩增对照时,没有发现非特异性产物的生成,表明该体系对于WNV的检测是特异的。将阳性对照标准品进行10倍梯度稀释后,可检测到102copies/μL样品,表明该检测体系具有很高的检测灵敏度。通过6次批间重复检测,体系的变异系数小于3%,表明该检测体系具有良好的可重复性。同时也对检测体系进行了重复性、特异性及检测灵敏度的评价。总之建立的检测体系可以用于我国疑似WNV感染的人群、动物来源样品的检测,同时也可用于血液、血液制品等中可能带毒的样品的系统监测。2.西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ在昆虫S2细胞中的表达与鉴定西尼罗病毒囊膜蛋白结构域Ⅲ（DomainⅢ）位于WNV病毒膜蛋白的最表面,是诱导机体产生抗体的主要保护性抗原,同时DomainⅢ也是WNV感染细胞时与细胞表面结合的主要位点。本研究根据GenBank中发表的WNV囊膜蛋白DomainⅢ基因序列设计了一对引物并分别引入NotⅠ和NcoⅠ酶切位点,用PCR方法扩增DomainⅢ基因片段。回收目的基因片段,并用NotⅠ和NcoⅠ限制性内切酶消化,经纯化后,将其定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5中,构建重组表达载体pMT-DⅢ。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin（杀稻瘟素）进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-DⅢ。提取S2-DⅢ细胞的基因组DNA,PCR法检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用终浓度500μmol/L的硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western Blotting检测。结果表明,本研究成功构建了重组表达载体pMT-DⅢ,转染细胞经12μg/mL的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达WNV E DomainⅢ蛋白的果蝇S2细胞株。筛选的昆虫细胞重组表达DomainⅢ蛋白,经初步鉴定与预期相符,为建立WNV抗体ELISA检测体系提供了标准对照抗原。3.WNV抗体检测体系的建立与评价利用重组的西尼罗病毒囊膜蛋白结构域Ⅲ蛋白作为标准抗原建立其抗体检测体系。通过优化条件确立抗原的最佳包被浓度为2.5ug/mL,对照用抗体使用浓度为1600倍稀释。对建立的体系进行评价表明,该检测体系对WNV的检测特异性较高,且对其它类似病毒如乙脑病毒、牛病毒性腹泻病毒等的检测交叉反应性低。批内检测时平均值为1.002,标准差为0.0423,变异系数为0.0422。批间检测时平均值为1.162,标准差为0.151,变异系数为0.130。本研究基于表达的囊膜蛋白DⅢ蛋白建立了WNV抗体的检测技术,检测的各项指标均符合检测的要求。总之这一检测体系的建立将为我国研制WNV各种抗体检测试剂提供技术及方法上的参考。

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摘要

Abstract

缩略语表（Abbreviation）

第一部分西尼罗病毒流行病学及检测技术研究现状（综述）

1 西尼罗病毒生物学特性的研究

1.1 西尼罗病毒的分类

1.2 西尼罗病毒的形态学特征

1.3 西尼罗病毒的基因组结构

1.4 西尼罗病毒基因组编码的蛋白及功能

1.4.1 结构蛋白与功能

1.4.2 非结构蛋白与功能

2 西尼罗病毒的流行病学特征及防制现状

2.1 西尼罗病毒的传染源

2.2 西尼罗病毒的传播途径

2.3 西尼罗病毒的易感者

2.3.1 易感人群

2.3.2 易感动物

2.4 西尼罗病毒近年流行特点分析

2.4.1 发病率与死亡率的上升

2.4.2 流行地域的扩展

2.4.3 广泛的鸟类动物宿主

2.4.4 广泛的蚊虫媒介

2.4.5 多种哺乳动物被感染发病死亡

2.5 防止西尼罗病毒感染的预防措施

3 西尼罗病毒检测技术研究进展

3.1 病毒分离接种法

3.2 空斑形成试验

3.3 免疫学检测方法

3.3.1 免疫荧光法

3.3.2 酶联免疫吸附法

3.3.3 免疫组织化学法

3.3.4 生物条形码检测法

3.4 核酸检测方法

3.4.1 常规RT-PCR

3.4.2 巢式RT-PCR

3.4.3 实时荧光定量PCR

3.4.4 核酸序列扩增分析

3.4.5 环介导的恒温扩增技术

4 展望

第二部分西尼罗病毒易感性研究现状（综述）

1 WNV主要突变位点与易感性之间的关系

1.1 结构蛋白功能与突变

1.2 非结构蛋白功能与突变

1.2.1 NS2蛋白的突变

1.2.2 NS5蛋白的突变

1.2.3 NS1蛋白基因相对保守

1.2.4 NS2B和NS3蛋白

2 WNV易感性与感染机体状态及相关因子之间的关系

2.1 WNV易感性与年龄之间的关系

2.2 WNV易感性与OAS及CCR5之间的关系

2.3 WNV易感性与CXCL10之间的关系

3 展望

第三部分西尼罗病毒荧光定量PCR检测体系的建立与评价

1 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 试剂

2.2 病毒与样本

2.3 主要仪器

2.4 靶序列选择及引物的设计

2.5 WNV基因组RNA的提取及cDNA的合成

2.6 标准品对照片段的扩增、克隆与定量

2.7 引物浓度的优化

2.8 标准品的扩增及标准扩增曲线的绘制

2.9 检测体系特异性的确定

2.10 检测体系的灵敏度及定量线性分析

2.11 重复性检测

3 结果

3.1 引物的Blast比对结果

3.2 标准品对照扩增结果

3.3 对照PCR扩增结果

3.4 引物使用浓度的确定

3.5 标准品对照质粒扩增曲线及标准回归曲线的分析

3.6 标准品熔解曲线分析

3.7 检测体系灵敏感度及特异性分析

3.8 重复性检测结果

4 讨论

4.1 基于SYBR Green Ⅰ建立的检测体系特点分析

4.2 本研究建立的体系优缺点分析

4.3 建立的RT-PCR检测体系应用前景分析

5 结论

第四部分西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ在S2细胞中的表达与鉴定

1 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞株

2.1.2 载体与基因

2.1.3 酶类及试剂

2.1.4 细胞培养用品

2.1.5 DNA和蛋白标准参照物

2.1.6 主要仪器、设备

2.2 表达载体pMT/DⅢ的构建

2.2.1 E DomainⅢ基因的PCR扩增

2.2.2 DomainⅢ基因的亚克隆

2.2.3 载体构建

2.2.4 质粒的提取

2.3 重组质粒的鉴定

2.3.1 双酶切鉴定

2.3.2 PCR鉴定

2.3.3 序列分析

2.4 果蝇S2细胞的培养

2.4.1 生长条件

2.4.2 冻存细胞

2.4.3 传代

2.4.4 果蝇S2细胞对Blasticidin抗性分析

2.5 脂质体转染果蝇S2细胞

2.5.1 果蝇S2细胞的准备

2.5.2 脂质体DNA的准备

2.5.3 细胞的转染

2.6 抗性细胞的筛选

2.7 抗性细胞的诱导表达

2.8 细胞表达上清的鉴定

2.9 细胞表达产物的鉴定

2.9.1 样品收集

2.9.2 样品的浓缩处理

2.9.3 SDS-PAGE和Western Blotting检测

3 结果

3.1 E DomainⅢ基因的PCR扩增

3.2 E DomainⅢ氨基酸全序列及空间结构预测

3.3 pMT/DⅢ重组子的菌落PCR鉴定

3.4 pMT/DⅢ重组质粒的酶切鉴定

3.5 细胞表达上清SDS-PAGE检测结果

3.6 细胞表达上清Western Blotting检测结果

3.7 抗性细胞基因组DNA的PCR检测结果

4 讨论

4.1 E DomainⅢ蛋白功能与特点分析

4.2 EDS表达系统特点介绍

4.3 基于DES表达的E DomainⅢ蛋白及应用情况分析

5 结论

第五部分 WNV抗体检测体系的初步建立与评价

1 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 WNV病毒株和培养用细胞株

2.1.2 重组WNV E DomainⅢ

2.1.3 主要用品及仪器

2.1.4 主要试剂及溶液配制

2.2 表达的WNV E DomainⅢ蛋白表达量的测定

2.3 免疫抗原的制备

2.4 阴性与阳性抗WNV血清的制备

2.5 阳性抗WNV血清的纯化

2.6 间接ELISA法确定E DomainⅢ的特异性

2.7 制备的WNV E DomainⅢ抗血清与WNV其它同源病毒反应性的检测

2.8 抗原最佳包被浓度与对照血清最佳稀释度的确定

2.9 封闭试剂与封闭条件的选择

2.10 酶标抗体工作浓度的确定

2.11 Cutoff值的确定

2.12 检测体系特异性的评价

2.13 批内、批间重复性的评价

3 结果

3.1 表达的WNV E DomainⅢ蛋白表达量检测结果

3.2 抗WNV血清与E DomainⅢ蛋白反应的特异性

3.3 WNV DomainⅢ蛋白抗血清纯化结果

3.4 WNV DomainⅢ蛋白ELISA使用浓度检测结果

3.5 检测体系封闭试剂与封闭条件的确定

3.6 封闭时间确定结果

3.7 酶标抗体工作浓度检测结果

3.8 Cutoff值的确定结果

3.9 体系特异性的检测结果

3.10 批内、批间重复性的检测结果

4 讨论

4.1 西尼罗病毒抗体检测体系的特点与应用领域

4.2 建立的抗体检测体系的优缺点分析与评价

5 结论

参考文献

致谢

附录

作者简历

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