以HBcAg-preS1表位融合蛋白为基础的新型HBV治疗性疫苗的构建、表达和免疫活性研究

论文摘要

乙肝是一种严重威胁人类健康的传染病,目前临床治疗仍没有特效药物。许多研究证实,细胞免疫和体液免疫在阻止HBV感染和病毒清除方面起到了关键的作用。因此,开发能特异增强机体细胞免疫和/或体液免疫的乙肝治疗性药物是该领域研究的热点。乙肝核心抗原（HBcAg）由于其独特的物理结构和免疫学性质而被人们认为是一种良好的分子载体。本研究利用基因工程技术对HBcAg基因e1区进行了修饰,使其变为能够良好递呈外源基因的分子载体。将前S1表位基因插入该区,构建了含有HBcAg和前S1表位融合基因的原核表达载体pBTcs1。在大肠杆菌中表达后,融合蛋白BTcs1经蔗糖密度梯度超速离心纯化。蛋白鉴定结果显示,融合蛋白BTcs1分子量约为28 kDa,能够与抗-preS1抗体和抗-HBc抗体特异杂交,且能够自主组装成病毒样颗粒（VLPs）结构,颗粒直径约为30-34 nm。融合蛋白BTcs1免疫Balb/c小鼠后,能够诱导出高滴度的保护抗体和Th1型免疫反应,表明BTcs1可能发展成为一种兼有预防和治疗作用的新型HBV疫苗。

论文目录

• 缩写词
• 第一章 文献综述
• 第一节 HBV 简介
• 1. HBV 的结构
• 2. HBV 的复制过程
• 3. HBV 的致病机理
• 第二节 HBV 感染的流行病学
• 第三节 HBV 感染治疗药物和存在的问题
• 1. 干扰素α
• 2. 核苷类似物
• 2.1 拉米夫定（Lamivudine）
• 2.2 阿德福韦酯（Adefovir dipivox）
• 2.3 恩替卡韦（Entecavir）
• 第四节 治疗性乙肝疫苗HBV（HBV therapeutic vaccine）
• 1. 治疗性疫苗简介
• 2. 治疗性乙肝疫苗研究进展
• 2.1 治疗性乙肝DNA 疫苗
• 2.2 重组蛋白疫苗
• 2.3 多肽疫苗
• 2.4 免疫复合物疫苗
• 第五节 HBcAg 和前S1表位的联合应用
• 1. 乙肝核心抗原（HBcAg）
• 1.1 乙肝核心抗原的结构特征
• 1.2 HBc 核心颗粒精细的三维结构
• 1.3 HBc 蛋白N 末端和C 末端与核心颗粒装配的关系
• 1.4 HBcAg 独特的免疫学性质
• 1.5 HBcAg 颗粒作为免疫载体
• 2. 前S1 抗原（preS1）
• 2.1 前S1 抗原的分子生物学
• 2.2 前S1 抗原的免疫学性质
• 3. 目前HBV 疫苗存在的问题和本研究意义
• 第六节 立题依据
• 第二章 材料和方法
• 第一节 材料
• 第二节 实验方法
• 1. 表达质粒pBTc 和pBTcs1 的构建及鉴定
• 1.1 表达质粒pBTc 的构建
• 1.2 表达质粒pBTcs1 的构建
• 1.3 表达菌株的制备
• 1.4 表达质粒pBTc 和pBTcs1 的DNA 鉴定
• 1.5 表达质粒pBTc 和pBTcs1 的蛋白质表达初步分析
• 2. 融合蛋白BTcs1 在工程菌中表达及纯化
• 3. 融合蛋白BTcs1 的理化特性和抗原性鉴定
• 3.1 融合蛋白BTcs1 的纯度鉴定
• 3.2 融合蛋白BTcs1 的浓度测定
• 3.3 电镜观察融合蛋白BTcs1 的颗粒形成
• 3.4 融合蛋白BTcs1 的抗原性鉴定
• 4. 融合蛋白BTcs1 的免疫活性测定
• 4.1 动物的分组和免疫
• 4.2 血清特异性抗体检测
• 4.3 脾细胞增殖功能测定
• 4.4 Th1/Th2 型细胞因子诱生实验
• 4.5 CTL 活性分析
• 5. 统计方法
• 第三章 实验结果
• 第一节 表达质粒pBTc 和pBTcs1 的DNA 鉴定和蛋白质表达分析
• 1. 表达质粒pBTc 和pBTcs1 的DNA 鉴定
• 2. 表达质粒pBTc 和pBTcs1 的蛋白质表达分析
• 第二节 融合蛋白BTcs1 的表达、纯化及鉴定
• 1. 细菌的培养和收获
• 2. 细菌的裂解和融合蛋白BTcs1 的纯化
• 3. 融合蛋白BTcs1 的理化特性和抗原性鉴定
• 3.1 融合蛋白BTcs1 的纯度鉴定
• 3.2 融合蛋白BTcs1 的浓度测定
• 3.3 电镜观察融合蛋白BTcs1 的颗粒形成
• 3.4 融合蛋白BTcs1 的抗原性鉴定
• 第三节 融合蛋白BTcs1 的免疫学活性
• 1. 抗体滴度测定和亚型分析
• 2. 脾细胞增殖功能测定
• 3. 脾细胞Th1/Th2 型细胞因子诱生
• 4. CTL 活性分析
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表和待发表的学术论文
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢
• 个人简历