一种新型抗真菌抗生素发酵工艺的研究

论文摘要

近年来,深部真菌感染率逐渐提高,对患者的健康和生命造成了很大的威胁。课题组筛选得到一株芽孢杆菌,能产生大环内酯类抗真菌抗生素,对引起深部真菌感染的白色念珠菌具有很好的抑制作用。该芽孢杆菌经16S rRNA序列测定和NCBI数据库BLAST搜索,确定其与B.subtilisst rain AU53的16S rRNA序列同源性为98%,鉴定为一株芽孢杆菌。本论文首先采用单因素法对该抗生素的摇瓶培养工艺进行优化,确定最佳发酵培养基组成（g/100mL）：可溶性淀粉浓度4%,黄豆饼粉0.825%,（NH4）2S041.375%,K2HPO4 0.24%, NaCl 0.2%,MgSO40.05%,CaCO3 0.072%,CuSO4 0.002%,FeSO40.002%,MnSO40.002%;最佳发酵条件：pH 6.5,接种量8%,转速200 rpm,装液量40 mL/250 mL,28℃下摇瓶发酵36 h产抗水平达到6364.343 U/mL,效价提高了8.37倍。采用响应面法优化该抗生素的摇瓶培养条件,通过Plackett-Burman试验发现影响产物生成量的3个主要因素：黄豆饼粉、可溶性淀粉和（NH4）2SO4。采用最陡爬坡试验和Box-Behnken试验设计得到响应面优化（RSM）后的最佳培养基组成（g/L）：黄豆饼粉2.77,可溶性淀粉27.2,（NH4）2SO4 3.73,其余同单因素优化后条件。采用上述优化后的培养基,抗生素效价由最初的6364.343 U/mL提高到16866.29 U/mL,提高了2.65倍。在摇瓶工艺优化基础上,进一步进行了5 L通气搅拌罐产抗试验。采用RSM优化后的培养基,在搅拌转速200 r/min、通气量1vvm、装液量60%（v/v）、接种量10%（v/v）条件下进行36小时的发酵,效价达到8305.841U/mL

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 抗真菌抗生素的介绍
• 1.3 目前市场上的抗真菌药物
• 1.4 抗真菌抗生素的抗菌机理和发展方向
• 1.5 研究内容
• 2 菌种鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 方法
• 2.2.5 改进的CTAB法提取细菌基因组DNA
• 2.2.6 电泳检测
• 2.2.7 PCR扩增反应体系
• 2.2.8 T载体连接体系
• 2.2.9 转化
• 2.2.10 挑选阳性克隆子并进行菌落PCR
• 2.2.11 质粒DNA提取
• 2.2.12 测序及进化树的建立
• 2.3 结果与讨论
• 2.4 小结
• 3 单因素优化摇瓶发酵条件
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 分析方法
• 3.3 结果讨论
• 3.3.1 葡萄糖标准曲线
• 3.3.2 制霉菌素标准曲线
• 3.3.3 发酵培养条件的单因素优化
• 3.3.4 发酵培养基组成的优化
• 3.4 小结
• 4 响应面优化发酵培养基
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 Plackett-Burman设计法筛选培养基成分中的重要因子
• 4.3.2 最陡爬坡实验设计
• 4.3.3 响应面法（RSM）确定最适培养基组成
• 4.4 小结
• 5 发酵小试工艺放大及抗菌活性研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 核酸与菌体干重的关系
• 5.3.2 发酵过程相关参数变化曲线
• 5.3.3 菌株代谢产物的抑菌效果
• 5.4 小结
• 6 结论与建议
• 6.1 结论
• 6.2 建议
• 参考文献