刺槐Na+/H+逆向转运蛋白基因克隆与序列分析及刺槐再生体系建立

论文摘要

盐胁迫严重影响植物产量和盐碱地的利用。高浓度的Na+导致植物细胞受到伤害,限制植物生长发育。提高植物的抗盐性是利用盐碱地的根本措施。植物Na+/H+逆向转运蛋白具有调节pH值和细胞内Na+浓度的平衡、减少盐胁迫对植物伤害的功能。开展Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与序列分析有助于从分子水平上进一步了解木本植物的耐盐机理,而在此基础上的试管苗再生体系研究则有助于耐盐良种迅速在生产中推广应用。本文以盐碱地区主要造林树种刺槐为研究对象,利用从刺槐根中提取的RNA,克隆Na+/H+逆向转运蛋白基因,并且对序列进行分析,同时建立了刺槐组织培养试管苗再生体系。刺槐Na+/H+逆向转运蛋白基因及生物信息学分析为了研究刺槐耐盐机理,利用3′RACE和5′RACE技术,从刺槐根中提取RNA,通过PCR技术克隆得到液泡型Na+/H+逆向转运蛋白基因。该基因命名为RpNHX1,在GenBank进行了注册,注册号为EF675631。序列分析表明,该cDNA序列为2281bp,其中包含555bp的5′的非编码区,118bp的3′的非编码区,1608bp的开放阅读编码框,编码535个氨基酸残基。RpNHX1与拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白AtNHX1的氨氯吡嗪咪结合位点一致为LFFIYLLPPI。研究发现刺槐RpNHX1与大豆（Glycine max）的GmNHX1、玫瑰（Rosa hybrid）的RhNHX1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtNHX1以及水稻（Orysa sativa）的OsNHX1的同源性很高,分别为85%、78%、74%和69%,而与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白同源性低,属于液泡型Na+/H+逆向转运蛋白NHX的NHX-I一簇。生物信息学方法预测发现,RpNHX1与AtNHX1具有相似的拓扑结构,即含有一个疏水的N末端,10个跨膜片段和一个具有调节功能的C-端亲水区域。疏水性数据表明第5个疏水区域有两个螺旋（H1和H2）,第6和第7疏水区域分别形成另外两个螺旋（H3和H4）。H1～H4螺旋区域含有多于1/4（11/40）带负电荷的氨基酸和2个带正电荷的氨基酸。在螺旋区域之间存在一串带负电荷的氨基酸,显示出有规律的排列模式,这些模式在生物界的Na+/H+逆向转运蛋白中通常是一致的。结合亲疏水资料,提出Na+/H+转运通道结构存在这一区域。另外,还分析了RpNHX1的糖基化、酰基化和磷酸化位点。综合研究数据可以看出,RpNHX1可能在细胞中起到Na+区隔化作用。刺槐试管苗再生体系建立本文以刺槐茎段、叶片为外植体,研究了芽增殖生长及试管苗生根技术,找出各阶段培养的最佳培养基。研究表明,细胞分裂素决定了芽增殖数目,生长素决定了芽的伸长。茎增殖的最适宜的培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L;芽伸长的最适宜培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。叶片再生不定芽的最佳培养基为MS+ 6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L。最适宜的生根培养基为1/2MS+IBA0.05mg/L或1/2MS+NAA 0.05mg/L

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 刺槐的概述
• 1.1.1 刺槐的原产地及其分布
• 1.1.2 刺槐的形态特征及生物学特征
• 1.2 刺槐组织培养的研究进展
• 1.2.1 刺槐茎尖与茎段培养
• 1.2.2 叶片、叶柄与叶轴培养
• 1.2.3 形成层培养
• 1.2.4 胚培养
• 1.2.5 原生质体培养
• 1.2.6 细胞悬浮培养
• 1.3 植物的耐盐机理
• 1.3.1 盐胁迫对植物的主要表现形式
• 1.3.2 植物的耐盐机理
• +/H⁺逆向转运蛋白研究进展'>1.4 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白研究进展
• +/H⁺逆向转运蛋白基因的克隆'>1.4.1 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的克隆
• +/H⁺逆向转运蛋白分子特征'>1.4.2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白分子特征
• +/H⁺逆向转运蛋白基因的功能'>1.4.3 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的功能
• +/H⁺逆向转运蛋白的表达调控与植物的耐盐性'>1.4.4 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的表达调控与植物的耐盐性
• 1.5 研究的目的与意义
• +/H⁺逆向转运蛋白基因克隆'>2 刺槐Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 常用试剂的配制
• 2.1.5 PCR 引物序列
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 材料的获取
• 2.2.2 刺槐根总RNA 的提取
• 2.2.3 2%琼脂糖凝胶变性电泳
• 2.2.4 反转录合成cDNA 的第一条链
• 2.2.5 目的基因cDNA 的分离
• 2.2.6 生物信息学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 刺槐总RNA 的提取
• +/H⁺逆向转运蛋白基因中间片段的获得'>2.3.2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因中间片段的获得
• +/H⁺逆向转运蛋白基因3′末端的获得'>2.3.3 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因3′末端的获得
• +/H⁺逆向转运蛋白基因5′末端的获得'>2.3.4 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因5′末端的获得
• +/H⁺逆向转运蛋白基因全长的克隆'>2.3.5 刺槐Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因全长的克隆
• +/H⁺+逆向转运蛋白基因核苷酸序列和氨基酸序列分析'>2.3.6 刺槐Na⁺/H⁺+逆向转运蛋白基因核苷酸序列和氨基酸序列分析
• +/H⁺逆向转运蛋白亲缘关系比较'>2.3.7 RpNHX1 与其他植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白亲缘关系比较
• 2.3.8 RpNHX1 的预测结构
• +/H⁺逆向转运蛋白的系统发育分析'>2.3.9 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的系统发育分析
• 3 刺槐组织培养体系建立
• 3.1 材料
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 无菌外植体的获取
• 3.2.2 不定芽增殖
• 3.2.3 试管苗生根
• 3.2.4 基本培养基与培养条件
• 3.2.5 数据统计与分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 不定芽增殖
• 3.3.2 不同激素对生根的影响
• 4 讨论
• +/H⁺逆向转运蛋白的结构'>4.1 刺槐Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的结构
• 4.2 盐胁迫信号下RPNHX1 功能
• 4.3 RNA 的提取
• 4.4 RACE 问题
• 4.5 植物激素对组培快繁的影响
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况