锌、铁和锰离子与乳铁蛋白联合对乙肝病毒体外作用的研究

论文摘要

牛乳铁蛋白是一种能由多种粘膜分泌的铁结合糖蛋白。乳铁蛋白可以抑制乙型肝炎病毒感染,金属结合乳铁蛋白对多种病毒有抑制作用,其缺铁乳铁蛋白、锌、铁、锰饱和乳铁蛋白可以在早期抑制脊髓灰质病毒、人体免疫缺陷性病毒、疮疹I型和II型病毒。本课题主要对缺铁乳铁蛋白以及锌、铁、锰饱和乳铁蛋白早期抗乙型肝炎病毒进行研究。本研究采用天然HBV感染HepG2细胞建立病毒细胞模型,通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）测定天然乳铁蛋白、缺铁乳铁蛋白以及锌、铁、锰饱和乳铁蛋白对细胞的毒性并确定最大无毒作用剂量,并以此剂量作梯度稀释进行抗病毒研究;试验采用ELISA法应用乙型肝炎表面抗原试剂盒检测乙型肝炎表面抗原的被抑制情况,同时采用荧光定量PCR法对HBV-DNA的被抑制情况进行测定。结果如下:⑴应用MTT法测定缺铁乳铁蛋白、锌饱和乳铁蛋白、铁饱和乳铁蛋白、锰饱和乳铁蛋白的细胞毒性,锌、铁和锰对细胞的最大无毒剂量（TD0）分别为1.5g?L-1、3.0 g?L-1和1.5 g?L-1,缺铁乳铁蛋白对细胞的半数中毒剂量（TD50）为8.312 g?L-1,最大无毒剂量（TD0）为1.5 g?L-1。试验均采用其无细胞毒性剂量进行抗病毒研究。⑵当HBV感染细胞以后,缺铁乳铁蛋白对HBsAg分泌无抑制作用（最高抑制率为14.78%）,对HBV-DNA没有显著抑制作用（P>0.05）,缺铁乳铁蛋白不能抑制乙型肝炎病毒。⑶当HBV感染细胞以后,锌饱和乳铁蛋白、铁饱和乳铁蛋白、锰饱和乳铁蛋白对HBV-DNA有显著抑制作用（P<0.05）,并呈现出剂量效应关系,抑制效果为:锌饱和乳铁蛋白>锰饱和乳铁蛋白>铁饱和乳铁蛋白,乳铁蛋白的铁饱和度以及结合的离子类型影响其抑制HBV-DNA效果。⑷单纯的锌、铁、锰离子不能抑制HBV-DNA,乳铁蛋白的抗HBV-DNA作用是蛋白与金属的整体作用。本研究结果表明,在体外锌、铁、锰饱和乳铁蛋白对HBV-DNA有显著的抑制作用,缺铁乳铁蛋白和单纯的锌、铁、锰离子对HBV-DNA无显著抑制作用,这说明其抑制作用与乳铁蛋白结合金属离子后的整体结构有关,但其作用机制应是多方面的,且有待于进一步探讨。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.1.1 研究的目的
• 1.1.2 研究的意义
• 1.2 乳铁蛋白与金属离子
• 1.2.1 乳铁蛋白的结构及与金属离子的结合部位
• 1.2.2 乳铁蛋白的抗病毒作用
• 1.2.3 金属离子对乳铁蛋白抗病毒的促进作用
• 1.2.4 乳铁蛋白的免疫调节功能
• 1.3 乙型肝炎简述
• 1.3.1 乙型肝炎病毒介绍
• 1.3.2 乙型肝炎的常用治疗药物
• 1.4 乳铁蛋白国内外研究现状
• 1.4.1 乳铁蛋白与病毒颗粒作用
• 1.4.2 乳铁蛋白与HCV 结合部位
• 1.4.3 临床应用
• 1.4.4 乳铁蛋白抗乙型肝炎研究现状
• 1.5 研究的主要内容
• 1.6 试验创新点
• 2 材料
• 2.1 仪器与设备
• 2.2 原料与主要试剂
• 3 方法
• 3.1 HepG2 细胞培养
• 3.1.1 细胞培养所需液体的配制
• 3.1.2 细胞复苏
• 3.1.3 细胞冻存
• 3.1.4 细胞传代和换液
• 3.1.5 细胞计数
• 3.2 乙肝病毒处理及 HBV 病毒转染 HepG2 细胞模型的建立
• 3.2.1 乙型肝炎病毒处理
• 3.2.2 乙型肝炎病毒转染HepG2 细胞模型的建立
• 3.3 金属结合乳铁蛋白的制备
• 3.3.1 原料乳铁蛋白的纯度检测
• 3.3.2 缺铁乳铁蛋白的制备
• 3.3.3 锌、铁、锰饱和乳铁蛋白的制备
• 3.4 细胞毒性试验
• 3.4.1 α-干扰素细胞毒性实验
• 3.4.2 缺铁乳铁蛋白细胞毒性实验
• 3.4.3 乳铁蛋白细胞毒性实验
• 3.4.4 锌、铁、锰饱和乳铁蛋白细胞毒性实验
• 3.5 ELISA 法测定 HBsAg 以及荧光定量 PCR 法测定 HBV-DNA
• 3.5.1 ELISA 法测定HBsAg
• 3.5.2 荧光定量PCR 法测定HBV-DNA
• 3.6 抑制乙型肝炎病毒试验
• 3.6.1 缺铁乳铁蛋白抗HBV 试验
• 3.6.2 锌、铁、锰饱和乳铁蛋白及天然乳铁蛋白抑制HBA-DNA 试验
• 3.6.3 金属元素抑制HBV-DNA 试验
• 3.7 统计分析
• 4 结果与分析
• 4.1 HepG2 细胞接种量及 HBV 病毒转染 HepG2 细胞模型的建立
• 4.2 原料的检测及铁、锌、锰饱和乳铁蛋白的制备
• 4.2.1 原料乳铁蛋白的检测
• 4.2.2 铁、锌、锰饱和乳铁蛋白的制备
• 4.3 细胞毒性试验结果
• 4.3.1 干扰素细胞毒性试验结果
• 4.3.2 缺铁乳铁蛋白细胞毒性试验结果
• 4.3.3 天然乳铁蛋白细胞毒性试验结果
• 4.3.4 锌、铁、锰细胞毒性试验结果
• 4.4 缺铁乳铁蛋白抗HBV 结果
• 4.4.1 缺铁乳铁蛋白抗HBsAg 试验结果
• 4.4.2 缺铁乳铁蛋白抑制HBV-DNA 试验结果
• 4.5 锌、铁、锰饱和乳铁蛋白及天然乳铁蛋白抑制HBV-DNA 试验结果
• 4.5.1 天然乳铁蛋白抑制HBV-DNA 试验结果
• 4.5.2 锌饱和乳铁蛋白抑制HBV-DNA 试验结果
• 4.5.3 铁饱和乳铁蛋白抑制HBV-DNA 试验结果
• 4.5.4 锰饱和乳铁蛋白抑制HBV-DNA 试验结果
• 4.5.5 锌、铁、锰饱和乳铁蛋白抑制HBV-DNA 组间对比结果
• 4.5.6 金属元素抑制HBV-DNA 试验结果
• 5 讨论
• 5.1 缺铁乳铁蛋白抑制乙型肝炎病毒表面抗原分泌试验
• 5.2 缺铁、饱和铁、天然乳铁蛋白抑制乙型肝炎病毒DNA 试验
• 5.3 锌、铁、锰饱和乳铁蛋白抑制乙型肝炎病毒DNA 试验
• 6 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文