论文摘要
捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素（galectin）含有串联重复的两个糖结合域（carbohydrate recognition domain，CRD）。雌、雄成虫重组galectin在C端CRD基序中存在一个差异氨基酸，雌虫中该基序是WGNEGR，而雄虫中该基序为WGNEER。这两种galectin在血凝活性、糖结合能力、体外抑制山羊外周血淋巴细胞细胞因子mRNA转录以及体外诱导山羊外周血淋巴细胞凋亡等方面均显示出一定的差异。基于以前的研究，本论文主要进行了以下工作：1．雌、雄捻转血矛线虫galectins C端Clid差异氨基酸的突变及其糖结合域的克隆通过定点突变技术更换Hco-gal-m与Hco-gal-f C端CRD的差异氨基酸。Hco-gal-mC端CRD（wGNEER）中的第二个E被突变为G，得到与HCO-gal-f相同的突变galectin（MG mutate）；Hco-gal-f C端CRD（WGNEGR）中的G被突变为E，得到与Hco-gal-m相同的突变galecthl（FE mutate）。DNA序列分析证明突变体碱基序列与设计序列完全一致。同时通过PCR分别克隆了Hco-gal-f／m 340bp左右的N端CRD（FNh、MNh）和540bp左右C端CRD（FCh、MCh），DNA序列分析证明碱基序列完全正确。2．重组galectins的原核表达及表达产物的纯化利用温度敏感原核表达系统在大肠杆菌中表达了重组MG mutate、FE mutate、MNh、MCh、FNh、FCh。SDS-PAGE分析发现重组MG mutate和FE mutate的分子量大小为32．5kDa左右、重组MNh和FNh为14.4kDa左右、重组MCh和FCh为20.0kDa左右。上述重组galectins以包涵体形式存在。用8mol／L尿素溶解包涵体使之变性后在含有递减浓度尿素的TE缓冲液中分步透析复性，可得到浓度较高重组galectins。3．捻转血矛线虫galectins C端CRD差异氨基酸突变对其血凝活性的影响通过比较Hco-GAL-f、Hco-GAL-m以及它们的突变体MG mutate、FE mutate对人B型红细胞的血凝活性来检测C端CRD中的第二个谷氨酸（E）对捻转血矛线虫血凝活性的影响。血凝试验发现，C端CRD中第二个氨基酸E的改变颠倒了重组galectins凝集人B型红细胞的能力。纯化重组Hco-GAL-m和Hco-GAL-f的最高凝集效价分别为2-8和2-6，而它们的突变体MG mutate和FE mutate，则分别是2-5和2-9。此结果说明，捻转血矛线虫C端CRD中第二个氨基酸E的改变影响了重组galectins的血凝活性。同时通过比较捻转血矛线虫galectins N端CRDs和C端CRDs的血凝活性发现，MCh和FCh的最高凝集效价分别为2-5和2-4，而MNh和FNh则分别为2-1和2-1，揭示四个重组CRD中C端CRDs凝集人B型红细胞的能力强于N端CRDs。糖抑制试验结果表明，乳糖和半乳糖都能有效抑制上述重组galectins的糖结合能力，乳糖最低抑制浓度低于半乳糖最低抑制浓度。4．捻转血矛线虫galectins C端CRD差异氨基酸突变对其糖结合能力的影响用亲和层析方法比较了重组Hco-GAL-f、Hco-GAL-m、MG mutate、FE mutate、MCh、FCh、MNh、FNh的糖结合能力，以此来检测C端CRD中的第二个谷氨酸（E）对捻转血矛线虫重组galectin糖结合能力的影响以及两端CRD糖结合能力的差异。比较亲和层析图谱发现Hco-GAL-m和FE mutate（Hco-GAL-f的突变体）能有效的结合于a-乳糖层析介质，而Hco-GAL-f、MG mutate（Hco-GAL-m的突变体）则不能与a-乳糖层析介质结合。MCh和FCh与a-乳糖层析介质的结合能力与Hco-GAL-m和FEmutate相比大大减弱，但仍存在；MNh和FNh则不能与a-乳糖层析介质结合。此结果表明，捻转血矛线虫C端CRD中第二个氨基酸E的改变影响了重组galectins的糖结合能力，并且C端CRDs的糖结合能力强于N端CRDs。5．捻转血矛线虫galectins诱导山羊淋巴细胞凋亡的活性部位的研究为了探讨重组的雄、雌捻转血矛线虫galectin（Hco-GAL-m／f）诱导天然宿主山羊外周血淋巴细胞凋亡的具体活性部位，采用DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪分析的方法，检测了重组Hco-GAL-f、Hco-GAL-m、MG mutate、FE mutate、MCh、FCh、MNh和FNh对淋巴细胞凋亡的影响。结果显示，重组Hco-GAL-m、Hco-GAL-f、MGmutate、FE mutate及四个CRD均可诱导细胞凋亡，DNA凝胶电泳见典型的梯形条带；流式细胞仪定量分析发现Hco-GAL-m和FE mutate诱导的凋亡淋巴细胞的数量多于Hco-GAL-f和MG mutate。而MNh、MCh、FNh和FCh诱导的凋亡淋巴细胞的数量明显少于Hco-GAL-m、FE mutate、Hco-GAL-f和MG mutate，四个CRD中并没有哪一个显示出较强的诱导淋巴细胞凋亡的活性。