绵羊肺炎霉形体的培养纯化研究与间接ELISA检测抗体方法的初步建立

论文摘要

绵羊肺炎霉形体（MO）所致绵羊肺炎霉形体病是目前羊场中发病率和致死率最高的疾病之一。本研究通过对绵羊肺炎霉形体进行菌株纯化，对比不同培养基，含不同血清的对比培养基和含不同抗生素浓度的对比培养基对绵羊肺炎霉形体生长的影响，从而纯化了绵羊肺炎霉形体菌株Y；优化筛选出以加入10％的猪血清和正常抗生素浓度FM-4培养基培养绵羊肺炎霉形体效果最好，为进一步研究其病原学和致病机理打下基础。在改良FM-4液体培养基中接种绵羊肺炎霉形体，48h后收集菌体，经蛋白酶抑制剂处理；通过抗原提取方法的筛选，采用低渗-冻融-超声裂解法获得MO菌体蛋白作为包被抗原，初步建立了检测该病抗体的间接ELISA方法。通过试验比较，确定了ELISA的最佳反应条件为：抗原包被浓度为17.5μg/ml；以含1％BSA的PBST为最佳封闭液，37℃反应2h；血清最佳工作浓度为1:320，37℃反应1h；酶标羊抗兔IgG的最佳工作浓度为1:5000，37℃反应1h；阴阳性临界值为0.084。菌体蛋白能阻断阳性血清与相应包被抗原的反应；与丝状支原体山羊亚种阳性血清、布氏杆菌阳性血清、链球菌C群阳性血清均无交叉反应；表明特异性好。包被好的反应板4℃保存3个月，其灵敏度不变。间接ELISA能够检测出的血清最高效价为1:2560，而间接血凝试验能检测的最高效价仅为1:64。建立的间接ELISA检测绵羊肺炎霉形体抗体方法，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、稳定可靠等优点，适用于该病的诊断与疫病普查。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 历史与分布
• 2 病原学
• 2.1 分类及形态特性
• 2.2 培养特性
• 3 抗原结构
• 4 流行病学
• 5 临床症状及病理变化
• 5.1 临床症状
• 5.2 病理变化
• 6 诊断方法
• 6.1 病原学培养诊断
• 6.2 血清学检测
• 6.3 分子生物学诊断
• 7 防治
• 7.1 药物治疗
• 7.2 防制措施
• 研究目的意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 血清
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器
• 2 方法
• 2.1 绵羊肺炎霉形体菌株纯化
• 2.2 绵羊肺炎霉形体培养条件优化
• 2.3 绵羊肺炎霉形体菌体的收集
• 2.4 绵羊肺炎霉形体菌体全蛋白的制备
• 2.5 兔抗绵羊肺炎霉形体阴性和阳性血清的制备
• 2.6 间接ELISA的操作方法
• 2.7 间接ELISA最佳反应条件的选择
• 2.8 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
• 2.9 特异性试验
• 2.10 重复性试验
• 2.11 保存期试验
• 2.12 敏感试验
• 结果
• 1 绵羊肺炎霉形体的培养纯化
• 1.1 绵羊肺炎霉形体的菌株纯化
• 1.2 绵羊肺炎霉形体培养条件优化
• 2 菌体全蛋白的制备方法
• 3 兔抗绵羊肺炎霉形体阴性和阳性血清的制备
• 4 间接ELISA最佳反应条件的选择
• 4.1 最佳抗原和血清工作浓度的选择
• 4.2 酶标羊抗兔IgG最佳工作浓度的选择
• 4.3 酶标羊抗兔IgG最佳工作时间的选择
• 4.4 不同封闭液及封闭时间的选择
• 4.5 阴性、阳性血清最适反应时间的选择
• 5 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
• 6 特异性试验
• 6.1 阻断试验
• 6.2 交叉反应试验
• 8 保存期试验
• 9 敏感试验
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表文章目录