论文摘要
目的食管癌是我国高发的恶性肿瘤。其发生是多种癌基因的激活与抑癌基因的失活长期协同作用的结果。基因异常甲基化是目前所知的除突变、缺失和移位之外的另一种基因异常改变,与其它基因异常相比,基因的甲基化研究不仅对恶性肿瘤的病因、早期诊断及预后评价有很大价值,而且对肿瘤的基因治疗研究有着重要的作用。目前已知,MT-3基因是细胞内一种金属硫蛋白的编码基因,不仅具有许多重要的生理功能,还可以抑制细胞增殖,已有研究发现MT-3基因在胃癌中存在异常甲基化。本课题应用MSP和RT-PCR方法检测食管鳞状细胞癌细胞株中的MT-3基因的甲基化情况及其对MT-3基因mRNA表达的影响,以揭示MT-3基因甲基化在食管癌发生、发展中的作用。方法1选取五种食管癌细胞株和正常人血液单核细胞,其中TE-1, TE-13, TTN和ECA-109为食管鳞状细胞癌细胞株,OE33为食管腺癌细胞株,应用RT-PCR技术,对其mRNA的表达情况进行研究,旨在揭示MT-3基因RNA表达与食管鳞状细胞癌发生的关系。2选取TE-1, TE-13, TTN,ECA-109和OE33五种食管癌细胞株,应用MSP技术,对其MT-3基因CpG岛的超甲基化情况进行研究,从而了解MT-3基因CpG岛的超甲基化状况与食管鳞状细胞癌发生的关系。3应用RT-PCR技术和MSP技术对五种食管癌细胞株经DNA甲基转移酶抑制剂5-氮2’-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理后进行研究,包括MT-3基因CpG岛甲基化情况和MT-3基因mRNA表达量的研究,以阐明MT-3基因CpG岛的甲基化和MT-3基因mRNA表达与食管鳞状细胞癌发生发展的关系。结果1 MT-3基因mRNA在试验的细胞中均有不同程度的表达。其中正常人血液单核细胞的MT-3表达量最大,其次为TE13,而OE33没有表达。2所有实验的食管鳞状细胞癌细胞株中MT-3基因mRNA的表达量明显低于正常人血液单核细胞的表达量（P<0.01）。3 MSP结果显示食管鳞状细胞癌细胞株中广泛存在MT-3基因CpG岛的甲基化,其中以TE1最重,没有非甲基化引物扩增产物,处于完全甲基化状态。其余三种食管鳞状细胞癌细胞株甲基化程度相对较弱,为半甲基化状态。4 MSP结果显示经5-Aza-CdR处理后五种食管癌细胞株的MT-3基因超甲基化状态均发生了去甲基化改变,最为明显的是TE13和OE33, TE13细胞株基本上发生了完全去甲基化,OE33细胞株也出现了明显的非甲基化引物扩增产物。5各细胞株经5-Aza-CdR处理后mRNA表达量较处理前明显增多（P<0.01）。结论1食管癌细胞株中存在不同程度的MT-3蛋白表达,其中OE33完全没有发现MT-3蛋白表达,其余四种食管鳞状细胞癌细胞株可检测到多少不等的MT-3蛋白表达。2实验的所有食管鳞状细胞癌细胞株的MT-3蛋白表达量明显低于正常人血液单核细胞的表达量,即食管鳞状细胞癌细胞株中存在广泛的MT-3蛋白表达水平下降。3实验的所有食管鳞状细胞癌细胞株的MT-3基因CpG岛广泛存在超甲基化。4 MSP结果显示:经5-Aza-CdR处理后的四种食管鳞状细胞癌细胞株中的MT-3基因CpG岛超甲基化状态均发生了不同程度的去甲基化改变。5食管鳞状细胞癌细胞株中广泛存在MT-3基因CpG岛的超甲基化,而且这些甲基化可以引起MT-3蛋白表达水平的下降。经5-Aza-CdR处理后,MT-3基因的甲基化状态解除,MT-3蛋白的表达水平也相应地升高。因此,MT-3基因CpG岛的超甲基化与食管鳞状细胞癌的发生和发展存在必然联系。
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