乳酸链球菌素产生菌株筛选及其抑菌机理研究

论文摘要

本研究针对乳酸链球菌素产生菌的筛选、鉴定,最佳培养条件,所产乳酸菌素的提取纯化及其抑菌机理进行了系统研究。从大白菜叶上分离得到21株对乳酸链球菌素（Nisin）有抗性的乳酸菌株,采用杯碟法从中筛选得到抑菌活性较强的菌株-T0625。经测定表明,发酵液经热处理,在低pH条件下能够保持较好的抑菌活性。发酵液的抑菌活性不受胃蛋白酶和胰蛋白酶的影响。发酵液对革兰氏阳性细菌具有明显的抑制作用,但对革兰氏阴性细菌、酵母菌和霉菌不表现抑制作用。通过形态学观察、生理生化测定以及16S rDNA测序,鉴定该菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.Lactis）,命名为Lactococcus lactis subsp.Lactis T0625。采用单因素分析法与正交试验相结合的方法,确定T0625菌株产乳酸菌素的最佳营养条件:葡萄糖2%、蛋白胨4%、酵母膏2%、牛肉膏1%、MgSO4·7H2O 0.003mol/L、Vc 0.05%。T0625产Nisin的最佳发酵条件:装液量250mL（250mL三角瓶）、接种量7%、起始pH 6.5、35℃下发酵培养12h。采用（NH4）2SO4盐析、透析、Sephadex G-50凝胶柱层析等方法提取纯化T0625菌株所产乳酸菌素,采用SDS-PAGE凝胶电泳方式检测提取纯化效果。提纯后的乳酸菌素经电泳检测,显示出与乳酸链球菌素标准品一致的条带,将该乳酸菌素命名为Nisin T0625。对乳酸菌素Nisin T0625的抑菌机理进行了初步研究。将Nisin T0625加入金黄色葡萄球菌培养液中进行抑菌试验。结果发现,培养液蛋白含量提高、电导率增加,未出现对数生长期。透射电镜观察发现,加入Nisin T0625后,菌体变形,出现质壁分离现象,进而菌体细胞破裂,细胞内容物大量外泄,菌体成为不规则残片。SDS-PAGE凝胶电泳显示,Nisin T0625作用使金黄色葡萄球菌菌体内蛋白减少,培养液中蛋白增加。推测Nisin T0625的作用位点为细胞膜,具有破坏菌体细胞膜完整性的作用。试验结果证明乳酸菌素Nisin T0625与乳酸链球菌素具有相似的抑菌机理,即支持了“孔道形成”理论的观点。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 天然食品防腐剂
• 2 乳酸菌素
• 3 乳酸链球菌素（Nisin）概述
• 4 乳酸链球菌素的生产工艺
• 5 乳酸菌及乳酸菌素的应用
• 6 乳酸菌素的发展前景
• 7 本课题研究的主要目的和内容
• 第一章 乳酸链球菌素产生菌株的分离筛选及其发酵液生物学特性的初步研究
• 1.1 材料、试剂与仪器
• 1.2 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 乳酸链球菌素产生菌的定向分离
• 1.3.2 乳酸链球菌素产生菌的筛选
• 1.3.3 菌株遗传稳定性的研究
• 1.3.4 乳酸链球菌素产生菌发酵液生物学特性的初步研究
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二章 乳酸链球菌素产生菌株的鉴定
• 2.1 材料、试剂与仪器
• 2.2 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 培养性状特征
• 2.3.2 个体形态特征
• 2.3.3 生理生化特性
• 2.3.4 T0625菌株基因组DNA的提取
• 2.3.5 T0625菌株16S rDNA PCR扩增产物的分析
• 2.3.6 T0625菌株16S rDNA序列分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 乳酸链球菌素产生菌株最佳培养条件的研究
• 3.1 材料、试剂与仪器
• 3.2 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 T0625菌株发酵液抑菌活性与生长量的关系
• 3.3.2 碳源对T0625菌株发酵液抑菌效果的影响
• 3.3.3 氮源对T0625菌株发酵液抑菌效果的影响
• 3.3.4 金属离子对T0625菌株发酵液抑菌效果的影响
• 3.3.5 最适碳源浓度对T0625菌株发酵液抑菌效果的影响
• 3.3.6 最适氮源浓度配比对T0625菌株发酵液抑菌效果的影响
• 3.3.7 最适金属离子浓度对T0625菌株发酵液抑菌效果的影响
• 3.3.8 装液量对T0625菌株发酵液抑菌效果的影响
• 3.3.9 接种量对T0625菌株发酵液抑菌效果的影响
• 3.3.10 起始pH对T0625菌株发酵液抑菌效果的影响
• 3.3.11 培养温度对T0625菌株发酵液抑菌效果的影响
• 3.3.12 T0625菌株营养条件的优化
• 3.3.13 T0625菌株发酵条件的优化
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 乳酸菌素的提取纯化
• 4.1 材料、试剂与仪器
• 4.2 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 蛋白质标准曲线的绘制
• 4）₂SO₄盐析曲线'>4.3.2 （NH₄）₂SO₄盐析曲线
• 4）₂SO₄的盐析'>4.3.3 （NH₄）₂SO₄的盐析
• 4.3.4 Sephadex G-50凝胶柱层析
• 4.3.5 SDS-PAGE凝胶电泳分析结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 乳酸菌素Nisin T0625抑菌机理的初步研究
• 5.1 材料、试剂与仪器
• 5.2 方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 乳酸菌素Nisin T0625最小抑菌浓度（MIC）的测定
• 5.3.2 乳酸菌素Nisin T0625对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响
• 5.3.3 透射电镜观察结果
• 5.3.4 乳酸菌素Nisin T0625对金黄色葡萄球菌培养液电导率的影响
• 5.3.5 乳酸菌素Nisin T0625对金黄色葡萄球菌培养液蛋白含量的影响
• 5.3.6 金黄色葡萄球菌菌体蛋白SDS-PAGE电泳分析
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 今后工作思路
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表文章