利用酵母双杂交系统筛选铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiC的相互作用蛋白

论文摘要

生物钟是调控生物代谢和行为的内源计时系统,它广泛存在于自然界的各种生物体内。蓝藻是目前已知的具有生物钟的最简单的生物。其生物钟核心是kai基因簇及其编码的KaiA、KaiB、KaiC蛋白。其中KaiC蛋白是蓝藻生物钟机制的核心部分,通过对kai基因簇转录的调控,可以调节Kai蛋白的表达,并且这3种蛋白则通过自身的相互作用,能够对KaiC的磷酸化状态进行调节,从而产生昼夜节律信息。KaiC磷酸化状态的变化会影响它与其他蛋白的相互作用,并使许多与生物钟相关的基因表达呈现出昼夜节律性。为了研究铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）的钟基因KaiC的功能,寻找与其相互作用的蛋白,本文利用酵母双杂交的方法来钓取未知的相关基因。在取得pGBKT7-kaiC后,我们检测了其能够在酵母AH109中正常表达,并且不会产生毒性影响酵母AH109的生长,且不具自激活性。实验表明,可以将pGBKT7-kaiC作为酵母GAL4双杂交系统的钓饵载体,从铜绿微囊藻基因组文库中钓取与KaiC相互作用的蛋白。利用载体pGADT7构建了铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa PCC 7820的染色体DNA文库,通过上述酵母双杂交系统的反复筛选和验证,共找到了11个不同的与KaiC蛋白有相互作用的蛋白,其中3个蛋白C99、C196及C10为铜绿微囊藻的蛋白。根据比对结果,我们对C99和C196进行了异源表达,并对其与KaiC蛋白的相互作用进行了进一步研究。由于铜绿微囊藻C99蛋白的基因序列未知,我们采用KaiC蛋白与铜绿微囊藻PCC 7820的KaiC蛋白具有很高的相似性的集胞藻中的OmpR代替C99进行研究。将集胞藻OmpR基因在大肠杆菌中得到可溶性表达后,通过体外pull-down的方法验证了其在体外与KaiC蛋白不会发生相互作用,同时酵母双杂交方法验证结果表明集胞藻中的OmpR蛋白与KaiC蛋白在体内也不会发生相互作用。另外,对铜绿微囊藻C196蛋白进行了在大肠杆菌的异源表达后,通过Far-western的方法验证了该蛋白在体外与KaiC蛋白有相互作用,进而推断C196很可能是与铜绿微囊藻生物钟调控有关的蛋白。本实验对与铜绿微囊藻生物钟蛋白复合体的核心部分KaiC蛋白的相互作用蛋白进行了初步的研究,对于阐明生物钟节律的信号输出途径提供了理论依据,为铜绿微囊藻生物钟分子机制的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 铜绿微囊藻简介和蓝藻生物钟研究进展
• 1.1 铜绿微囊藻简介
• 1.2 生物钟介绍
• 1.3 蓝藻生物钟研究进展
• 2 酵母双杂交系统介绍
• 2.1 酵母双杂交原理
• 2.2 用于酵母双杂交筛选的铜绿微囊藻基因组文库
• 3 本论文研究的目的和意义
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 实验流程
• 实验结果与分析
• 1 铜绿微囊藻基因文库的构建
• 1.1 铜绿微囊藻染色体DNA的不完全酶切
• 1.2 基因组文库构建
• 7-kaiC的有效性检测'>2 重组质粒pGBKT₇-kaiC的有效性检测
• 3 利用酵母双杂交筛选与生物钟蛋白KaiC相互作用的蛋白
• 3.1 筛选基因组文库中与KaiC的相互作用蛋白
• 3.2 回复验证阳性克隆的有效性
• 3.3 测序结果分析
• 4 集胞藻PCC 6803的ompR基因的克隆、表达及其与KaiC相互作用的验证
• 4.1 集胞藻PCC 6803的ompR基因的克隆表达
• 4.2 蛋白OmpR与KaiC相互作用的检验
• 5 铜绿微囊藻藻中c196基因的克隆、表达及其与KaiC蛋白相互作用的验证
• 5.1 铜绿微囊藻c196基因基因的扩增
• 5.2 重组表达载体的构建
• 5.3 GST-C196蛋白的表达与纯化
• 5.4 Far-western验证C196与KaiC间的相互作用
• 讨论
• 1 铜绿微囊藻基因文库的构建
• 2 酵母双杂交的筛选
• 3 基因组文库筛选的蛋白功能
• 小结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢