RNA干涉用于Survivin性质的研究

论文摘要

Survivin 是1997 年Ambrosini 等应用EPR-1 基因cDNA 作为探针去筛选人基因组文库而得到的,是IAP 家族的一个成员,以其独特的分子结构以及表达特点,在其被发现后的几年中得到广泛的研究与关注。本论文中,我们用蛋白合成抑制剂放线菌酮CHX处理宫颈癌细胞HeLaS3,并用Western-blot 检测,发现60min 后Survivin 蛋白的表达量明显降低。而用PKA 的抑制剂H89 预先处理细胞两个小时后,再用CHX 处理细胞,则Survivin蛋白量变化不明显。我们推断,Survivin 的稳定性可能与其潜在的PKA 磷酸化位点的磷酸化状态有关。进而通过序列比对,我们选择出三条针对Survivin 基因的siRNA 片段,并构建了相应的RNAi 载体,转染入HeLaS3 细胞后,瞬时转染的结果表明,Survivin 表达量在RNA 和蛋白水平上都得以下调,尤以S3 片段效果最为明显,并且用流式细胞术检测干涉载体转染对细胞产生的生物学效应,发现转染干涉载体pTet-U6-S3 后,细胞凋亡率得到很大的提高。另外,我们构建了Survivin 上潜在的pKA 磷酸化位点Ser81 的突变体S81D、S81A,用来检测该位点磷酸化不同状态对Survivin 稳定性的影响。但是把干涉载体转染至细胞,并把其培养成稳定株后,HeLaS3 细胞内源Survivin 量并没有被有效地抑制,这是很出乎预料的。

论文目录

• 第一章 前言
• 一、细胞凋亡及凋亡途径
• 1.1 细胞凋亡简介
• 1.2 细胞凋亡途径
• 二、凋亡调控蛋白分子
• 2.1 Bcl-2 家族
• 2.2 IAP 蛋白家族
• 三、 Survivin 简介
• 3.1 Survivin 结构特点
• 3.2 Survivin 表达特点
• 3.3 Survivin 生物功能
• 四、 泛素-蛋白酶体降解通路
• 五、 RNA 干涉
• 5.1 RNA 干涉的机制
• 5.2 RNA 干涉的应用
• 5.3 RNA 干涉的特点
• 5.4 常用来制备siRNA 的方法
• 5.5 产生RNAi的方法
• 5.6 在治疗性研究中的问题
• 六、本论文的设计目的
• 第二章 Survivin 泛素化降解初步研究
• 一 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 试剂盒
• 1.3 其他试剂
• 二 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 CHX 溶液配制
• 2.3 细胞加药处理
• 2.4 Western blot 检测
• 2.5 Survivin 及其突变体真核表达载体的构建
• 2.6 连接产物细菌转化与鉴定
• 三 实验结果
• 3.1 CHX 处理细胞HeLa53
• 3.2 H89和CHX共同作用HeLa53细胞
• 3.3 突变片段和pCMV-Myc 和pCMV-HA 载体鉴定
• 四 讨论
• 本章小结
• 第三章 RNAi 对HeLa53内源Survivin表达的影响
• 一 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 试剂盒
• 1.3 其他试剂
• 二 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 Survivin 的siRNA 载体构建
• 2.2.1 siRNA 片段的合成
• 2.2.2 siRNA 片段和载体的处理
• 2.2.3 siRNA 片段和载体的连接
• 2.2.4 连接产物细菌转化,鉴定
• 2.3 细胞的转染
• 2.3.1 HeLa 细胞的培养和转染
• 2.3.2 HeLa53 细胞的培养和转染
• 2.3.3 HeLa53、MCF-7、HepG2 细胞的培养和转染
• 2.4 RT-PCR分析细胞中Survivin的m RNA表达水平
• 2.5 Western blot 印迹分析
• 2.6 流式细胞术（FCM）检测细胞周期
• 2.7 定量分析
• 2.8 RNAi 稳定株的筛选
• 2.9 Survivin 全长质粒的构建
• 2.9.1 设计Survivin 全长的上下游引物
• 2.9.2 连接产物细菌转化,鉴定
• 2.9.3 pIRES-hrGFP-Survivin 质粒构建
• 2.9.4 连接产物细菌转化、鉴定
• 2.10 细胞转染与荧光显微镜观察
• 三 实验结果
• 3.1 连接产物细菌转化、鉴定
• 3.2 转染干涉载体后细胞中Survivin 蛋白的变化
• 3.3 干涉载体转染48h后HeLa53细胞中Survivin mRNA的变化
• 3.4 转pTet-U6-53 干涉质粒后HeLa 53 细胞的凋亡
• 3.5 pTet-U6-51/-52/-53 稳定株的筛选与鉴定
• 3.6 T载体-Survivin cDNA 鉴定
• 3.7 T 载体-Survivin cDNA 的测序结果
• 3.8 转染质粒pIRES-hrGFP-Survivin 细胞荧光显微镜下的观察
• 四 讨论
• 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢