人细胞色素P450氧化还原酶基因多态性对抗癌药物及环境毒物活化的影响研究

论文摘要

人NADPH-细胞色素P450氧化还原酶（EC 1.6.2.4;NADPH-Cytochrome P450Oxidoreductase;POR）是定位在内质网膜上的一个重要的黄素蛋白（Williams et al.,1962;Phillips et al.,1962）,它是唯一的传递电子给人细胞色素P450（CytochromeP450,CYP）酶系以帮助完成CYP酶的氧化功能的辅酶（Poter et al.,1991）。POR整体敲除对小鼠具有胚胎致死性（Shen et al.,2002;Otto et al.,2003）,而POR的肝部定点敲除的小鼠在形态和生殖上都是正常的,只是其肝部代谢药物的能力大大下降（Gu et al.,2003;Henderson et al.,2003）。POR能够还原一系列内/外源性的电子受体,包括:细胞色素c,铁氰化钾和2,6-二氯靛酚（Williams et al.,1962）。它还能够代谢活化一些重要的药物,如丝裂霉素C（Keyse et al.,1984）,环磷酰胺和苯三嗪SR4233（Walton et al.,1992）,以及环境毒物,如百草枯。编码人POR的基因具有很强的基因多态性。自从2004年六个POR的错义突变体（带有氨基酸改变的,Y181D、A287P、R457H、V492E、C569Y和V608F）首次被报道后（Arlt et al.,2004;Fluck et al.,2004）,到目前为止已有共计40个不同的POR错义突变体被报道（Miller et al.,2008;Hart et al.,2007;Dhir et al.,2007）。这些报道对于POR的错义突变体的功能研究主要集中于其对一系列激素代谢紊乱相关疾病的发生的影响上,然而关于其在药物与环境毒物代谢活化中的作用却鲜有涉及。本课题系统地考察了已报道的POR错义突变体在POR参与的抗癌药物及环境毒物代谢活化中的影响。首先,利用Flp-InTMCHON胞系统重组表达了POR野生型及28个错义突变体,考察了POR错义突变体对代谢直接底物丝裂霉素C产生细胞毒性的影响;继而进一步建立了能同时表达CYP酶系和POR的双表达细胞系,以考察POR的突变体对CYP286介导的环磷酰胺代谢活化及CYP2A13介导的黄曲霉毒素代谢活化的影响。具体三部分的实验如下所述:1.稳定转染POR突变体的细胞系构建及其对丝裂霉素C的敏感性研究该部分实验应用Flp-InTMCHO系统成功地构建了含POR的28种错义突变体cDNA的表达载体,并完成稳定转染得到经Western blot鉴定能稳定表达POR野生型及各突变体的Flp-InTMCHO细胞系。之后以该细胞系完成了POR突变体对丝裂霉素C这一重要抗癌前体药物经POR代谢活化引起的细胞毒性的影响的研究。实验结果显示,表达突变体R316W,H628P和V631I的细胞对丝裂霉素C的耐受性显著提高。而对于突变体Y459H和L565P,表达它们的细胞其对丝裂霉素C的敏感程度几乎和表达空载体的空白细胞一致。本实验中得到的该细胞系还可进一步应用于研究POR介导的其他化合物的代谢活化。2.利用双表达系统考察POR突变体对于CYP286介导的环磷酰胺细胞毒性的影响该部分实验中使用了Flp-InTMCHO细胞系统先随机稳定转染表达了人CYP286,而后利用通过活性筛选确定的CYP286表达量较高的单克隆细胞进行二次转染,使得POR野生型及突变体cDNA定点稳定转染后插入细胞基因组的Flp-InTM位点,从而保证了CYP286和POR野生型及各突变体在不同的转染细胞系中的表达量的一致性。再进一步比较选定的POR各突变体对CYP介导的环磷酰胺代谢的影响。实验结果显示,共转染了突变体M263V和C569Y的细胞表现出与转染了野生型POR的细胞相近的对环磷酰胺的敏感度。然而,共转染了其他突变体的细胞对环磷酰胺的耐受性则都有不同程度的提高。特别是突变体Y181D和L565P,共转染了这两个突变体的细胞几乎与仅表达CYP286的细胞（共转染了空的pcDNA5质粒）对环磷酰胺的敏感度相似。并且实验结果也提示了不同的POR错义突变体的作用可能具有底物依赖性。3.利用双表达系统考察POR突变体对于CYP2A13介导的黄曲霉毒素B1细胞毒性的影响该部分实验也利用了所建立的Flp-InTMCHO细胞双表达系统共表达了CYP2A13与POR野生型及所选的5个突变体。并在这一细胞系统上考察了POR突变体对CYP2A13介导的黄曲霉毒素B1代谢活化引起的细胞毒性的影响。实验结果显示,共转染了突变体M263V和A503V的细胞表现出与转染了野生型POR的细胞相近的对黄曲霉毒素B1的敏感度。然而,共转染了其他突变体的细胞其对黄曲霉毒素B1的耐受性则都有不同程度的提高。特别是突变体Y459H,共转染了这个突变体的细胞几乎与仅表达CYP2A13的细胞（共转染了空的pcDNA5质粒）对黄曲霉毒素B1的敏感度相似。结合上一部分,本实验的结果提示,POR的错义突变体对不同的CYP酶介导的底物代谢活化的影响可能有所不同。因此,很难仅从POR突变体支持一种CYP酶介导的某一个底物的催化反应中的情况来推测其对其他所有的CYP酶及底物的支持能力。在将来的研究当中可以进一步利用本实验中建立的细胞体系对更多的CYP酶及底物进行研究,也可用同样的体系对CYP酶系的基因多态性功能进行研究。本课题得到的实验结果提示POR的基因多态性在个体对抗癌药物及环境毒物的代谢活化过程有重要影响,可作为指导相关抗癌药物个体化给药以及调查人群对相关环境毒物易感性的生物标记物。并且本课题的研究为进一步建立起一个完整的应用于临床的POR基因多态性的功能数据库奠定了坚实的基础。

论文目录

• 致谢
• 前言
• 论文创新点
• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 目次
• 第1章 绪论
• 1.1 人细胞色素P450氧化还原酶简介
• 1.2 POR参与代谢活化的重要抗癌药物及环境毒物
• 1.3 POR的基因多态性
• 1.4 POR基因多态性作用相关研究中常用的方法
• TM系统'>1.5 Flp-In^TM系统
• 1.6 本课题的研究目的与方案
• 第2章 稳定转染POR突变体的细胞系构建及其对MMC敏感性研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验步骤与方法
• 2.4 实验结果
• 2.5 实验讨论
• 第3章 利用双表达系统考察POR突变体对于CYP2B6介导的环磷酰胺细胞毒性的影响
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验步骤与方法
• 3.4 实验结果
• 3.5 讨论
• 第4章 利用双表达系统考察POR突变体对于CYP2A13介导的黄曲霉毒素细胞毒性的影响
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.3 实验步骤与方法
• 4.4 实验结果
• 4.5 实验讨论
• 第5章 结论与展望
• 参考文献
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果