论文摘要
第一章人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定目的探讨人外周血来源的内皮祖细胞（EPCs）体外诱导培养和扩增的方法,以期证实人外周血是临床治疗缺血性疾病一个理想的内皮祖细胞来源。方法密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞（MNCs）,接种在人纤维连接蛋白包被培养板,用含VEGF的培养液培养7天,收集贴壁细胞,激光共聚焦显微镜和流式细胞仪鉴定EPCs。结果从成人外周血可分离获得MNCs经体外培养,表达内皮细胞的特异性抗原,包括AC133、CD34和VEGFR-2,并显示出能内吞乙酰低密度脂蛋白（acLDL）,结合UEA-1等内皮细胞的功能,提示这些培养的细胞具有内皮细胞的表面蛋白特性和具有内皮细胞的功能。结论人外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs,可体外扩增和收集,为EPCs的进一步研究及临床应用奠定了基础。第二章白藜三醇对人外周血内皮祖细胞数量和功能的影响目的观察白藜三醇（Res）对人外周血内皮祖细胞（endothelialprogenitor cells,EPCs）数量和功能的影响。方法密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,培养7d后,收集贴壁细胞并加入不同浓度Res(1,10,25和50μmol·L-1)干预一定时间（6,12,24和48h）。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪鉴定EPCs。采用MTT比色法、粘附能力测定实验、改良的Boyden小室、体外血管生成试剂盒,分别观察EPCs的增殖、粘附、迁移、体外血管生成能力。另外,流式细胞仪检测细胞周期、ELISA法检测上清VEGF的表达。结果Res呈量效和时效地增加EPCs数量,50μmol·L-1Res作用24 h对EPCs数量的影响最为显著（112.8±7.2 VS 62.3±4.5,P＜0.01）。Res也显著改善了EPCs的增殖（0.433±0.042 VS 0.254±0.050,P＜0.01）、粘附（56.2±5.1 VS 35.2±3.5,P＜0.01）、迁移（30.8±5.1 VS 15.3±3.1）、体外血管生成能力（57.5±5.4 VS 25.2±3.7,P＜0.01）。此外,细胞周期分析示50μmol·L-1Res显著增加S期、降低G0-G1期比例。Res还能促进VGEF的分泌。结论白藜三醇可增加EPCs数量并改善其功能。第三章白藜三醇对人外周血内皮祖细胞衰老影响及其机制的探讨研究背景:研究发现雌激素能通过增加端粒酶活性延缓EPCs的衰老。白藜三醇是一种来源于葡萄的多酚类植物类抗毒素,是雌激素受体的激动剂,并有研究发现其能延长果蝇和酵母的寿命,但其机制尚不清楚。因此我们推测Res亦能延缓EPCs的衰老。目的:探讨白藜三醇是否能延缓EPCs的衰老及其对端粒酶活性的影响。方法:从人的外周血分离EPCs并鉴定其特性。体外培养后7 d后,收集细胞并加入白藜三醇(1,10,25和50μmol·L-1)干预。SA-β-半乳糖苷酶（Senescence-associatedβ-galactosidase）化学染色等指标观察细胞衰老,Southern blotting检测hTERT的蛋白表达水平、实时荧光定量PCR检测hTERT-mRNA的表达、PCR-EL ISA方法检测端粒酶活性。结果Res能呈剂量依赖抑制EPCs的衰老,增加hTERT、hTERTmRNA的表达,显著地增加端粒酶的活性。结论白藜三醇可能通过激活EPCs端粒酶活性发挥其抗衰老作用。
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