检测隐孢子虫卵囊的单抗介导IFA和夹心ELISA方法的建立及初步应用

论文摘要

隐孢子虫是一种重要的人兽共患机会性致病原虫,可通过食源和水源等途径传播,主要引发免疫抑制人群和易感动物腹泻,有重要的公共卫生意义。免疫学检测方法有特异性强、灵敏度高等特点,应用广泛。本综述介绍了免疫荧光技术、酶免疫分析法、免疫层析法、免疫印迹法、免疫磁珠分离法、流式细胞仪技术等几种常用的隐孢子虫免疫学检测方法,并初步分析了各种方法的优缺点。用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测出郑州郊区某奶牛场奶牛感染安氏隐孢子虫（C. andersoni）的阳性样品。经过饱和蔗糖溶液漂浮法收集安氏隐孢子虫卵囊,用蔗糖密度梯度离心、滤器滤过提纯,通过冻融和超声波处理制备颗粒性抗原,免疫Balb/c小鼠。以PEG2000为融合剂,取阳性颗粒性抗原免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性孔方法,通过3-5次有限稀释克隆化,筛选出4株持续分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4F8-E4-E3、4F8-D10、4G3-F3和4G3-F7；通过ELISA、IFA和EITB测其反应性,结果显示,4株杂交瘤细胞培养上清效价在1：100～1：12800之间,诱生腹水效价分别在1：6400～1：102400之间；4株单抗均特异性识别C. andersoni卵囊壁抗原；免疫印迹表明,4株单抗分别与38～97.2 KDa之间的主要抗原蛋白条带起反应。隐孢子虫单克隆抗体的制备和应用,极显著地提高了隐孢子虫免疫学检测方法的特异性、敏感性和稳定性。笔者建立了间接免疫荧光和双抗体夹心ELISA两种检测隐孢子虫卵囊的免疫学方法。以抗安氏隐孢子虫卵囊壁4F8单抗为一抗,以FITC标记羊抗鼠IgG为二抗,确定4F8单抗最佳稀释度1：800,4F8单抗和荧光抗体最佳作用时间分别为60 min和30min。该法检测隐孢子虫具有属特异性,不与艾美耳球虫卵囊和贾第虫包囊发生交叉反应,检测隐孢子虫卵囊阈值是2×102个/g。对30头份疑似感染隐孢子虫的奶牛粪便样品进行间接免疫荧光检测,并与抗酸染色镜检法比较,结果显示,抗酸染色法检测出7份阳性样品,间接免疫荧光对这7份判断为阳性外,还对抗酸染色阴性的2份判断为阳性。本研究为隐孢子虫病的诊断和环境中隐孢子虫卵囊的检测方法提供了参考。用纯化隐孢子虫卵囊制备免疫原,经油相苗共6次免疫制备了兔抗安氏隐孢子虫高免血清,提纯IgG抗体备用,IgG蛋白浓度为2.183 mg/mL。用兔抗安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni） IgG作为捕获抗体,抗安氏隐孢子虫单克隆抗体4F8作为检测抗体,HRP标记的羊抗鼠IgG为显示抗体,成功建立从粪便样品中检测隐孢子虫卵囊抗原的双抗体夹心ELISA方法。试验结果表明：IgG抗体最佳稀释度为1：400,即最适包被量为5.5mg.L-1；4F8单抗最适工作浓度1：1600；适宜封闭液为1% BSA-PBST;底物显色时间为15 min；对安氏隐孢子虫卵囊的最低检出量为2×104个/mL。对50头份奶牛粪便样品分别进行饱和蔗糖溶液漂浮、抗酸染色法镜检和双抗体夹心ELISA法检测,结果两种方法都检测出10例阳性,而夹心ELISA对其判断为阴性的3例检测为阳性,运用福尔马林-乙酸乙酯沉淀浓集方法再次检查,发现3份样品确含有隐孢子虫卵囊。该法具有隐孢子虫属特异性。特异性阻断试验、交叉试验和重复性试验结果表明该法特异性和敏感性较好、适宜于群体检测和隐孢子虫病的诊断。

论文目录

• 致谢
• 目录
• 摘要
• 文献综述
• 1 隐孢子虫的内生发育史
• 2 隐孢子虫抗原抗体分析
• 3 隐孢子虫的感染和病理特点
• 4 隐孢子虫病诱发机体的体液免疫和细胞免疫
• 5 隐孢子虫的免疫学检测方法
• 5.1 免疫荧光技术
• 5.2 酶免疫分析法
• 5.3 免疫层析法
• 5.4 酶联免疫电转印
• 5.5 免疫磁珠分离法
• 5.6 流式细胞仪技术
• 5.7 小结
• 试验一:抗安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）单克隆抗体的制备与鉴定
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 试剂配制
• 1.2.1 饱和蔗糖溶液
• 1.2.2 2.5%重铬酸钾溶液
• 1.2.3 改良抗酸染色液的配制
• 1.2.4 HAT选择培养基
• 1.2.5 HT选择培养基
• 1.2.6 1640营养液
• 1.2.7 1640维持液
• 1.2.8 冻存液
• 1.2.9 融合剂
• 1.3 SDS-PAGE电泳用试剂
• 1.3.1 30%丙烯酰胺分离胶贮备液
• 1.3.2 浓缩胶缓冲液（1.0M pH6.8Tris-HCl）
• 1.3.3 10%十二烷基硫酸钠（SDS）
• 1.3.4 10%过硫酸铵（AP）
• 1.3.5 分离胶缓冲液（1.5M pH8.8Tris-HCl）
• 1.3.6 5×样品缓冲液
• 1.3.7 5×SDS-PAGE电泳缓冲液
• 1.3.8 考马斯亮蓝染色液
• 1.3.9 考马斯亮蓝脱色液
• 1.4 免疫印迹试剂
• 1.4.1 膜转移缓冲液
• 1.4.2 TBST-Buffer
• 1.4.3 NC膜封闭液
• 1.4.4 HRP-DAB底物显色试剂盒
• 1.5 主要仪器
• 1.6 实验动物及细胞
• 1.7 方法
• 1.7.1 安氏隐孢子虫的检测
• 1.7.2 安氏隐孢子虫卵囊的收集和纯化
• 1.7.3 免疫用卵囊抗原的制备
• 1.7.4 BALB/C小鼠的免疫
• 1.7.5 检测免疫小鼠血清效价间接ELISA方法的建立
• 1.7.6 杂交瘤细胞株的建立
• 1.7.7 单克隆抗体的鉴定
• 2 结果
• 2.1 卵囊检测及纯化图片
• 2.2 杂交瘤细胞的筛选
• 2.3 单抗特异性试验
• 2.4 间接ELISA方法的建立
• 2.4.1 抗原包被浓度和血清稀释度的确定
• 2.4.2 抗原包被条件的确定
• 2.4.3 封闭剂的选择
• 2.4.4 酶标二抗最佳作用时间的确定
• 2.4.5 底物显色时间的确定
• 2.5 杂交瘤细胞培养上清及腹水中单抗效价测定
• 2.6 单抗识别抗原表位的鉴定
• 2.7 免疫印迹定位
• 2.8 单克隆抗体的稳定性测定
• 3 讨论
• 3.1 卵囊的检测、收集和纯化
• 3.2 影响单抗制备的因素
• 3.2.1 无菌操作
• 3.2.2 融合剂PEG
• 3.2.3 饲养细胞
• 3.2.4 培养基
• 3.3 识别卵囊壁的单抗
• 3.4 隐孢子虫抗原的多样性
• 3.5 隐孢子虫单抗特性
• 试验二:隐孢子虫卵囊间接免疫荧光检测方法的建立
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 标准阳性对照和阴性对照的设立阳性和阴性对照的设立及判定标准
• 1.2.2 样品的预处理
• 1.2.3 间接免疫荧光法IFA操作程序[81]
• 1.2.4 间接免疫荧光法IFA反应条件的确定
• 1.2.5 隐孢子虫属内检测及敏感性试验[30]
• 1.2.6 阻断试验与阴性对照试验
• 1.2.7 特异性试验
• 1.2.8 临床样品的检测
• 2 结果
• 2.1 IFA反应条件的确定
• 2.1.1 一抗工作浓度和孵育时间的测定
• 2.1.2 荧光二抗最适作用时间的确定
• 2.1.3 一抗稀释液的选择
• 2.2 阻断试验与阴性对照试验
• 2.3 特异性试验
• 2.4 IFA检测四种隐孢子虫结果
• 2.5 隐孢子虫属内检测结果及敏感性试验
• 2.6 临床样品检测结果
• 3 讨论
• 3.1 样品的预处理
• 3.2 待检标本的固定
• 3.3 检测误差
• 3.4 免疫荧光检测方法的应用情况
• 3.5 荧光显微镜观察
• 3.6 小结
• 试验三:单抗介导的隐孢子虫双抗体夹心ELISA检测方法的建立
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 兔抗C.andersoni高免血清的制备
• 1.1.2 兔抗C.andersoni IgG的制备和纯化
• 1.1.3 抗C.andersoni单克隆抗体的制备和鉴定
• 1.1.4 样品来源
• 1.1.5 待检样品的预处理
• 1.2 方法
• 1.2.1 兔抗C.andersoni IgG包被浓度和单抗工作浓度的确定
• 1.2.2 封闭液及作用时间的选择
• 1.2.3 底物显色时间的确定
• 1.2.4 特异性试验
• 1.2.5 特异性阻断试验
• 1.2.6 灵敏度的测定
• 1.2.7 属内检测
• 1.2.8 重复性试验
• 1.2.9 双抗体夹心ELISA的初步应用
• 2 结果
• 2.1 兔抗C.andersoni IgG纯度鉴定及蛋白含量测定
• 2.2 兔抗C.andersoni IgG与单抗最佳工作浓度的确定
• 2.3 封闭液及作用时间的选择
• 2.4 特异性试验
• 2.5 特异性阻断试验
• 2.6 灵敏度的测定
• 2.7 交叉试验
• 2.8 夹心ELISA重复性试验
• 2.9 双抗体夹心ELISA初步应用的结果
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 个人简历