SELDI-TOF-MS在研究胎儿先天性发育缺陷中的初步应用

论文摘要

背景与目的:先天性发育缺陷是指人类出生时表现的所有类型的发育异常,包括结构畸形、功能缺陷、代谢异常、遗传及行为等各方面所有的异常。流行病学、遗传学、分子生物学等研究提示,导致出生缺陷发生的原因,约有20%-25%主要由遗传因素所致,10%由环境因素（包括物理、生物、化学及营养因素等）引起,65-70%可能是环境与遗传因素相互作用的结果。据各有关资料统计,先天发育缺陷出生人数占总出生人数的2%-7%,神经管畸形及染色体异常是先天性发育缺陷中最为常见的疾病之一。降低出生人口的缺陷、提高出生人口素质是人类共同关注的问题。鉴于我国人口基数大、出生人口多,出生缺陷是影响我国人口素质的重要因素,已成为影响我国国民经济发展和人们正常生活的社会问题,提高出生人口素质,是提高中华民族人口素质的前提和基础,是促进我国经济繁荣和社会健康发展的有利保障。产前诊断（prenatal diagnosis）又称宫内诊断（intrauterine diagnosis）或出生前诊断（antenatal diagnosis）,是在胎儿出生前,应用各种检测方法对某些先天性、遗传性疾病作出诊断,进行选择性流产或宫内治疗,从而降低先天性缺陷儿的出生率,达到优生目的。它需要影像学、产科、细胞遗传学、生物化学以及分子生物学等技术相互协作共同完成,是跨专业、跨学科的一门学科,是对近代诊断学的重大进展,已成为临床产科学的重要组成部分。然而,目前产前诊断工作主要局限于对胎儿异常的发现和干预,而对胎儿异常的发病因素、发病机制及预防的研究鲜见报道,因此选择适当的检查方法研究胎儿先天性发育缺陷的各种生物学变化、发病机制、疾病的相关标记分子、药物靶点、筛选高敏感性和特异性的胎儿异常标志物等势在必行,蛋白质组学的出现为我们攻克这一难题带来了希望和曙光。蛋白质组学是以蛋白质为研究对象,其指的是一个细胞、组织或体液中所表达的全部蛋白质。蛋白质组学研究基因组在不同时间和空间编码的全部蛋白质的组成及作用规律,动态描述基因调节,对蛋白质进行定量的测定,研究疾病、药物对生命过程的影响,以及解释基因表达调控的机制。蛋白质组学的研究核心是通过对常见病理个体蛋白质组的测试分析,搜索出与疾病相关的有共性的特异性蛋白质分子,为探讨发病机制,设计新药物,为疾病的早期诊断和对预后的预测提供分子水平的实验与理论依据。作为基因组学研究的拓展,蛋白质组学研究成为世界生命科学领域的一个极其活跃的部分,是功能基因组时代或“后基因组时代”的核心部分,成为生物医学领域探索性研究的强有力工具。蛋白质组技术是最近才开始用于生殖医学的研究,虽然在生殖医学领域尚未广泛应用,但它的出现为生殖医学研究提供了新技术,增加了新的研究方向。应用这些方法有助于全面理解产前诊断相关疾病的病理生理变化,成功确定相应的蛋白质生物标志物有可能改变产前诊断相关疾病的早期诊断和治疗。目前蛋白质组学研究多采用传统的蛋白组学技术,例如双向电泳、质谱等,但这些技术受到技术条件要求高、步骤繁琐、耗时冗长等因素的限制,使差异蛋白质组学研究大规模地迅速开展受到限制。表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（Surface-enhanced laser desorption ionization time of flight massstectrometry,SELDI-TOF-MS）是近几年发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法,融合了质谱和芯片两大技术的优点,具有高通量、高灵敏度等特点,能对样品中蛋白质进行全景式分析,进而同时发现多个特异性标志物,为肿瘤早期诊断、疗效监测等提供了崭新的技术平台。羊水,是指怀孕时子宫羊膜腔内的液体,是维持胎儿生命所不可缺少的重要成分,并是诊断胎儿疾病生物标志物的潜在、丰富的来源。本研究在当前正在开展的孕母血清筛查、超声筛查,超声引导下羊膜腔穿刺,羊水细胞培养及染色体核型分析的工作基础上,利用SELDI-TOF-MS蛋白质芯片飞行质谱技术研究正常胎儿与染色体异常胎儿、正常胎儿与神经系统异常胎儿的羊水蛋白质组学,建立正常胎儿羊水蛋白质组指纹图谱,利用蛋白质组学技术结合基因组学方法和生物信息学,研究比较正常胎儿与异常胎儿羊水在正常生理或病理状态下所表达的蛋白质的差异,寻找异常胎儿的特异性蛋白质分子,为探索胎儿染色体异常、胎儿神经系统畸形的病因学、发病机制、病理生理学变化提供蛋白质水平的研究依据,为异常胎儿的早期诊断提供分子标志,为染色体异常胎儿、神经系统畸形胎儿的预防、治疗、新药设计提供新的分子靶点。第一部分应用SELDI-TOF-MS筛选染色体异常胎儿羊水中特异性蛋白质的研究目的:分析染色体异常胎儿羊水和染色体正常胎儿羊水的蛋白质表达差异。方法:运用SELDI-TOF-MS技术检测染色体异常胎儿羊水和染色体正常胎儿羊水蛋白质表达图谱。胎儿羊水采用WCX2（弱阳离子交换芯片）捕获蛋白、PBSⅡC型蛋白质芯片阅读仪读取数据、Protein-Chip software 3.2软件采集数据、Biomarker wizard软件分析2组之间差异蛋白。结果:发现染色体异常胎儿羊水和染色体正常胎儿羊水的蛋白质表达图谱存在5个差异蛋白,其中4967.526Da、5258.056 Da、6868.197 Da3个蛋白及4134.51 Da 5423.397 Da2个蛋白在染色体异常组表达分别下调或上调。结论:SELDI-TOF-MS技术发现的表达于染色体正常胎儿和染色体异常胎儿羊水中的5个差异蛋白,为胎儿染色体异常的病因、发病机制、病理生理学变化提供了蛋白质水平的研究依据,可能成为预防、治疗、新药设计的新的分子靶点和早期诊断染色体异常胎儿的重要标志物。第二部分应用SELDI-TOF-MS筛选神经系统畸形胎儿羊水特异性蛋白质的研究目的:分析神经系统畸形胎儿羊水和神经系统正常胎儿羊水的蛋白质表达差异。方法:运用SELDI-TOF-MS技术检测神经系统先天畸形胎儿羊水和神经系统正常胎儿羊水蛋白质表达图谱。胎儿羊水采用WCX2（弱阳离子交换芯片）捕获蛋白、PBSⅡC型蛋白质芯片阅读仪读取数据、Protein-Chip software 3.2软件采集数据、Biomarker wizard软件分析2组之间差异蛋白。结果:发现神经系统先天畸形胎儿羊水和神经系统正常胎儿羊水的蛋白质表达图谱存在9个差异蛋白,其中4967.5Da、5258.0 Da、11717.0 Da3个蛋白及2540.4 Da、3107.1 Da、3396.8 Da、4590.965 Da、5589.2 Da、6429.4 Da6个蛋白在神经系统异常组表达分别下调或上调。结论:SELDI-TOF-MS技术发现的表达于神经系统先天畸形及神经系统正常的胎儿羊水之间的9个差异蛋白,为神经系统畸形胎儿的病因、发病机制、病理生理学变化提供了蛋白质水平的研究依据,可能成为预防、治疗、新药设计的新的分子靶点和早期诊断神经系统先天畸形胎儿的重要标志物。总结1.本研究是由影像、超声介入、遗传、基础、产科各学科相互协调配合共同完成,是一项跨专业、跨学科的综合性研究,产前筛查、诊断胎儿先天性发育缺陷的工作流程为利用SELDI-TOF-MS技术研究胎儿羊水蛋白质组学打下坚实的研究基础。2.应用SELDI-TOF-MS技术获得胎儿羊水蛋白质表达图谱的实验方法稳定可靠,具有良好的重复性,是研究胎儿羊水蛋白质组学的有效方法。3.应用SELDI-TOF-MS技术初步建立了正常胎儿、染色体异常胎儿、神经系统畸形胎儿羊水蛋白质组指纹图谱。4.m/z 4134.51 Da、4967.526Da、5258.056 Da、6868.197 Da、5423.397 Da的5个差异蛋白质可能是染色体异常胎儿羊水潜在的特异性生物标志物。5.m/z 2540.4 Da、3107.1 Da、3396.8 Da、4590.965 Da、4967.5 Da、5258.0 Da、5589.2 Da、6429.4 Da、11717.0 Da的9个差异蛋白质可能是胎儿神经系统畸形羊水潜在的特异性生物标志物。6.SELDI-TOF-MS技术在分子水平对开展胎儿先天性发育缺陷的研究工作具有广阔的应用前景。创新点1.首次在中期妊娠产前筛查、诊断胎儿先天性发育缺陷的工作流程基础上利用SELDI-TOF-MS先进技术体系对胎儿羊水进行蛋白质组学研究。2.首次应用SELDI-TOF-MS技术初步建立了正常胎儿、染色体异常胎儿、神经系统畸形胎儿羊水蛋白质组指纹图谱。3.首次在染色体异常胎儿的羊水中检测出5个差异蛋白质,它们可能是染色体异常胎儿潜在的羊水特异性生物标志物。4.首次在神经系统畸形胎儿的羊水中筛选出9个差异蛋白质,它们可能是胎儿神经系统畸形潜在的羊水特异性生物标志物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要英文缩略词表
• 前言
• 附图
• 第一部分 应用SELDI-TOF-MS筛选染色体异常胎儿羊水特异性标志物
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 参考文献
• 第二部分 应用SELDI-TOF-MS筛选神经系统畸形胎儿羊水特异性标志物
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 参考文献
• 总结与展望
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
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