论文摘要
支气管哮喘（简称）的本质是变态反应性气道慢性炎症。然而,在哮喘的免疫发病机制中,经典的Th1/Th2失衡理论很难解释哮喘免疫调节失常的全过程,还存在其他免疫学机制参与调节哮喘气道炎症的形成。最近研究发现调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg）是CD4+T淋巴细胞的一个亚群,能积极的控制或抑制其他细胞的功能,抑制免疫反应,从而对机体免疫系统产生重要的调节作用。支气管哮喘是气道慢性炎症性疾患,同时也是外周免疫耐受机制发生缺陷的疾病。越来越多的证据表明,Treg与哮喘变态反应性炎症和维持机体自身免疫耐受有着密切的关系。CD4+CD25+Treg由Sakaguchi等首先描述,是天然存在的Treg,又称胸腺源性Treg,是调节性T细胞的主要组成成分,在哮喘的免疫学发病中起着重要的作用。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells ,MSCs）是骨髓中造血干细胞外的另一类具有高度可塑性的细胞群体,在特定的诱导条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、肌细胞、神经细胞、脂肪细胞等间质细胞分化的能力,具有广泛的临床应用前景。近年的研究表明,MSCs除具有多向分化潜能外,还具有免疫调节作用。骨髓MSCs可上调CD4+CD25+Treg比例,抑制混合淋巴细胞反应（MLR）中或丝裂原（PHA）刺激引起的T淋巴细胞的增殖。MSCs不表达主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）、Fas配体和T细胞共刺激分子B7-1、B7-2、CD40、CD40L,MSCs不易被宿主免疫细胞识别,并能逃避免疫系统的免疫排斥。异基因MSCs不但可以进入受体的免疫器官,而且可在体内较长期存在。因此,MSCs用于细胞治疗具有独特的优势,但MSCs能否上调哮喘小鼠CD4+CD25+Treg,改善哮喘小鼠气道炎症,具有治疗哮喘的潜在临床应用前景,目前尚未见报道。我们将体外扩增的MSCs植入哮喘小鼠体内,观察MSCs对哮喘小鼠外周血CD4+CD25+Treg及气道炎症的影响,然后采用大鼠抗小鼠CD25+单克隆抗体去除哮喘小鼠外周血CD4+CD25+ Treg,观察哮喘小鼠去除CD4+CD25+Treg后气道炎症的变化以及骨髓间充质干细胞对去除CD4+CD25+ Treg哮喘小鼠气道炎症的影响,探讨MSCs减轻哮喘小鼠气道炎症的可能机制。本研究包括三个部分:第一部分小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定第二部分间充质干细胞上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞减轻气道炎症第三部分间充质干细胞对去除CD4+CD25+调节性T细胞哮喘小鼠气道炎症的影响一、小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的:建立一种从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞（mMSCs）的高效方法,并在体外进行传代扩增和鉴定。方法:采取贴壁筛选法分离和纯化小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）,检测mMSCs在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化能力,用流式细胞术及显微镜分别检测mMSCs纯度和形态特征。结果:mMSCs贴壁生长后形态较均一,细胞形态呈成纤维细胞样,流式细胞术检测:CD45,CD11b,CD44及CD29分别为3.34%,2.41%,98.46%,99.36%。第四代mMSCs经诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化。结论:贴壁筛选法分离小鼠骨髓MSCs效率和纯度高,稳定性好。分离培养的细胞其形态、流式细胞术检测的表面标记和多向分化潜能符合MSCs的特征。成功分离、培养、扩增小鼠骨髓MSCs为进一步动物实验奠定了基础。二、间充质干细胞上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞减轻气道炎症目的:探讨同种异体骨髓间充质干细胞（MSCs）对哮喘小鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）及气道炎症的影响。方法:将健康6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠30只随机分为3组,每组10只,分别为正常对照组（A组）、哮喘模型组（B组）、MSCs处理组（C组）,B组和C组以500μg/ml卵白蛋白（OVA）溶液0.2ml腹腔注射致敏,以5%OVA溶液雾化吸入激发建立小鼠哮喘模型,A组以等量生理盐水代替OVA,C组在诱导哮喘的第10天经尾静脉注入小鼠骨髓MSCs,流式细胞术检测小鼠外周血CD4+CD25+Treg占淋巴细胞的比例,并检测小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数,结合病理切片分析气道炎症情况。结果:A组、B组、C组小鼠外周血CD4+CD25+Treg占淋巴细胞比例分别为（5.81±0.76）%、（3.21±0.74）%、（5.12±0.34）%,A组和B组比较差异有统计学意义（P<0.01）,B组和C组比较差异有统计学意义（P<0.01）;A组小鼠BALF中炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞计数分别为（5.93±1.86）×104/ml、（0.06±0.04）×104/ml,B组小鼠BALF中炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞计数分别为（51.15±7.42）×104/ml、（14.24±2.84）×104/ml,C组小鼠BALF中炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞分别为（24.87±3.15）×104/ml、（4.34±0.44）×104/ml,A组和B组比较差异有统计学意义（P<0.01）,B组和C组比较差异有统计学意义（P<0.01）;病理切片显微镜下观察,A组小鼠气道无明显炎症改变,B组小鼠支气管、血管粘膜下和周围肺组织有明显炎症细胞浸润、气道上皮增生、气道黏液增多、气道上皮部分断裂脱落,C组小鼠气道炎症明显减轻。结论:静脉输注小鼠骨髓MSCs能上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+Treg比例,同时对哮喘小鼠气道炎症有显著抑制作用。上调CD4+CD25+Treg可能是MSCs抑制哮喘小鼠气道炎症的作用机制。三、间充质干细胞对去除CD4+CD25+调节性T细胞哮喘小鼠气道炎症的影响目的:观察小鼠骨髓间充质干细胞对去除CD4+CD25+Treg哮喘小鼠气道炎症的影响,探讨MSCs上调CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）在改善哮喘小鼠气道炎症中的作用。方法:将健康六周龄SPF级雌性BALB/c小鼠40只,随机分为5组,每组8只,分别为正常对照组（A组）,哮喘模型组（B组）,去除Treg细胞哮喘模型组（C组）,MSCs处理组（D组）,去除Treg细胞MSCs处理组（E组）, B组﹑C组﹑D组和E组以500μg/ml卵白蛋白（OVA）溶液0.2ml腹腔注射致敏,以5%OVA溶液雾化吸入激发建立小鼠哮喘模型,A组以生理盐水代替OVA,C组和E组小鼠在激发前1天尾静脉注射0.25mg大鼠抗小鼠CD25+单克隆抗体,并在激发试验第三天强化注射0.25mg大鼠抗小鼠CD25+单克隆抗体,维持Treg细胞低水平。D组与E组在诱导哮喘的第10天经尾静脉注入0.2ml浓度调整为1×106/ml的MSCs,其余三组经尾静脉注入等量PBS。流式细胞术检测外周血CD4+CD25+Treg占淋巴细胞的比例,检测小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数,结合病理切片分析气道炎症情况。结果:A组、B组、C组、D组、E组小鼠小鼠外周血CD4+CD25+Treg占淋巴细胞比例分别为（5.86±0.48）%、（3.60±0.41）%、（0.32±0.11）%、（4.72±0.22）%、（0.33±0.11）%,A组和B组比较差异有统计学意义（P<0.01）,B组和C组比较差异有统计学意义（P<0.01）;A组BALF炎症细胞总数及Eos分别为（4.93±1.68）×104 /ml、（0.03±0.01）×104 /ml ,B组为（62.84±9.67）×104 /ml、（18.93±3.40）×104 /ml,C组为（80.59±11.34）×104 /ml、（29.26±5.43）×104 /ml,D组为（27.68±4.92）×104 /ml、（4.87±0.55）×104 /ml,E组为（29.59±6.67）×104 /ml、（5.51±1.75）×104 /ml,A组BALF炎症细胞总数及Eos计数与其它四组相比有统计学意义（P<0.01）。B组﹑C组﹑D组和E组BALF炎症细胞总数及Eos计数组间比较有统计学意义（P<0.01）;光镜下小鼠气道炎症程度评分正常对照组0 （01）分,B组3（24）分,C组4 （34）分,D组2（13）分,E组2 （13）分,组间比较有统计学意义（H=32.527,P<0.01）,A组小鼠与其它4组比较,炎症改变有显著差别（P<0.01）;D组﹑ E组气道炎症改变较B组和C组有所减轻, C组较B组炎症改变有所加重（P<0.05）,D组和E组炎症改变无显著差别（P>0.05）。结论:和未去除外周血CD4+CD25+Treg的哮喘小鼠相比,哮喘小鼠去除外周血CD4+CD25+Treg其气道炎症显著加重,静脉输注MSCs能上调哮喘小鼠外周血CD4+CD25+Treg比例,对哮喘小鼠气道炎症具有显著的抑制作用。去除外周血CD4+CD25+Treg的哮喘小鼠静脉输注MSCs,其气道炎症仍呈现明显抑制作用,与未去除外周血CD4+CD25+Treg哮喘小鼠相比,MSCs对去除外周血CD4+CD25+Treg哮喘小鼠气道炎症的抑制作用有所减弱,但与未去除外周血CD4+CD25+Treg哮喘小鼠相比并无显著性差异。结果进一步表明外周血CD4+CD25+Treg比例下降参与了哮喘小鼠气道炎症的形成,MSCs上调外周血CD4+CD25+Treg比例仅仅是其抑制哮喘小鼠气道炎症的机制之一,MSCs对哮喘小鼠气道炎症的影响还存在其他重要机制。
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