论文摘要
在细胞周期的各个时相中存在着检测点（Checkpoint）,它能识别细胞周期进程中出现的错误,并诱导细胞产生抑制性因子,阻止细胞周期继续运行。当DNA复制受到干扰或者DNA损伤发生时,细胞周期的检测点就被激活,使细胞有足够的时间修复DNA损伤,待细胞损伤修复后,细胞周期又恢复运转,通常被称为细胞周期的恢复（Recovery）,这一过程对于细胞维持细胞周期的节律性和保障DNA传递的保真性至关重要。细胞周期存在3个检测点,即G1,S期和G2/M期检测点,根据DNA损伤的性质,S期检测点又可以细分为DNA双链断裂引起的Intra-S-Checkpoint和复制压力（Replication Stress）引起的复制检测点（ReplicationCheckpoint）。复制压力激活ATR激酶,通过一系列的磷酸化级联反应而激活复制检测点,但细胞从复制检测点恢复的机制,目前并不清楚。Artemis蛋白是个多功能的蛋白,最早被发现参与免疫球蛋白基因重组的V（D）J重排过程,也被认为是个抑癌基因,近年来它被发现还具有重要的细胞周期调控功能。在细胞受到电离辐射（IR）时,Artemis蛋白能被ATM激酶磷酸化,从而促进细胞周期从G2/M监测点恢复。Artemis蛋白磷酸化也已被证实参与细胞应对复制压力的反应,但该蛋白在细胞复制压力下如何被磷酸化,和它的磷酸化的功能尚有待阐明。本工作首先用凝胶泳动迁移实验和磷酸化特异性抗体证实了细胞应对复制压力时Artemis四个磷酸化位点发生了磷酸化,其中S516和S645发生迅速和持久的磷酸化而S534和S538发生短暂的磷酸化,并且证实ATR是S516和S645的磷酸化激酶。接着我们建立了稳定表达各种磷酸化位点突变的细胞系,流式细胞仪检测发现S516-645A（丝氨酸突变为丙氨酸）双突变的HEK 293细胞从复制检测点恢复延缓,Artemis蛋白敲低也得到同样的结果,而Artemis S516-645A突变并不影响Artemis对复制压力引起的DNA损伤的修复功能。Artemis S516-645A突变和Artemis敲低都引起Cyclin E蛋白的水平升高,而维持在高水平的Cyclin E阻碍了Cyclin A/Cdk2复合体的形成,从而阻碍了S期的恢复。蛋白酶体通路抑制剂MG-132阻断实验和蛋白合成抑制剂Cycloheximide阻断实验证实了Artemis是在转录后水平调控Cyclin E蛋白的。进一步的研究发现,Artemis通过Fbw7介导的泛素化通路影响Cyclin E的降解,Arte mis蛋白还调控Fbw7蛋白的其它底物,包括C-Jun,C-Myc和Notch1蛋白。本研究首次表明,细胞受到复制压力时,ATR通过磷酸化Artemis的S516和S546位点,调控S期复制检测点的恢复,而不影响Artemis对复制压力引起的DNA损伤的修复功能。高水平的Cyclin E可以阻碍细胞周期的恢复,Artemis蛋白S516和S645位点的磷酸化通过Fbw7介导的泛素化通路调控Cyclin E蛋白的降解,从而调控细胞周期从S期复制检测点恢复。