蝴蝶石斛兰再生体系的优化与香味相关基因ODOI的克隆

论文摘要

本研究以两个不同品种的蝴蝶石斛兰（Den.phalaenopsis var.）杂交种子作为试验材料,研究了蝴蝶石斛兰原球茎增殖,壮苗生根过程中基本培养基的成分、BA、NAA、椰子水的用量、碳源等因子对蝴蝶石斛兰增殖与生长发育的影响,优化了蝴蝶石斛兰种子原球茎再生体系;实验用蝴蝶石斛兰杂交种子作为外植体,接种在3/4MS+0.5mg/L BA+1.0mg/L NAA+1.0 g/L AC+20.0 g/L白糖+5.8g/L琼脂的培养基上,经过2 mo.的培养,得到最大量的原球茎。原球茎接种在MS+BA 2.0mg/L+NAA0.5mg/L +CW5%+白糖20.0 g/L +琼脂粉5.8g/培养基上,45d后获得最大量的增殖,2个月后开始分化出小苗;小苗在1/2MS+ 2.0mg/L IBA +1.5mg/L NAA +20% CW + 20.0 g/L白糖+ 5.0g/L琼脂的培养基上培养50d,可形成带有4～5片叶,3～4条根的小苗。与已报道的结果相比,种子直接诱导原球茎和壮苗生根培养基中基本培养基内除大量元素外的各种元素的量均减少了1/31/2,而整个再生过程缩短了20d以上;在原球茎增殖培养基中添加20%（体积比）CW代替5-10%香蕉汁和马铃薯汁,不仅效果好,而且使用更为方便。实验从模式植物矮牵牛花蕾中提取RNA,根据GenBank中编码为AY705977的ODOI的cDNA序列分别从起始密码子到终止密码子设计特异引物,用RT-PCR方法成功分离出ODOI基因,经双向测序和同源性比较,与GenBank中该基因的编码序列同源性为100%,片断大小为841bp;构建了UBI-pTCK303-ODOI植物表达载体,并通过基因枪法介导将该基因转化蝴蝶石斛兰原球茎,以期获得ODOI转化植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 热带兰的生物学习性
• 1.2 热带兰的生产与需求现状
• 1.3 热带兰组织培养研究进展
• 1.3.1 热带兰的再生途径
• 1.3.2 外植体
• 1.4 热带兰生物技术育种研究进展
• 1.4.1 热带兰遗传转化方法
• 1.4.2 热带兰遗传转化的选择标记基因及报告基因
• 1.5 花香物质相关酶及基因的研究进展
• 1.5.1 花香物质关键基因的克隆与分离
• 1.5.2 ODOI 基因
• 1.6 本研究的目的、意义及技术路线
• 1.6.1 研究的目的和意义
• 1.6.2 技术路线
• 2 蝴蝶石斛兰种子原球茎再生体系的优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 蝴蝶石斛兰原球茎的诱导
• 2.2.2 蝴蝶石斛兰原球茎的增殖与分化
• 2.2.3 蝴蝶石斛兰壮苗生根
• 2.2.4 炼苗与移栽
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 2.4.1 外植体的选择与原球茎的诱导
• 2.4.2 原球茎增殖和分化培养基
• 2.4.3 壮苗生根培养基
• 2.4.4 炼苗与移栽
• 3 香味相关基因ODOI 的克隆与植物表达载体的构建
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂与溶液
• 3.1.3 菌种
• 3.1.4 质粒载体
• 3.1.5 基因枪轰击元件
• 3.2 方法
• 3.2.1 矮牵牛花蕾总RNA 的提取
• 3.2.2 RT-PCR 引物设计与合成
• 3.2.3 RT-PCR 扩增
• 3.2.4 RT-PCR 片段的回收与双酶切
• 3.2.5 RT-PCR 片段与T 载体连接
• 3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.7 重组质粒转化感受态细胞
• 3.2.8 提取白色单菌落的质粒，酶切鉴定阳性及测序
• 3.2.9 序列分析
• 3.2.10 植物表达载体的构建
• 3.2.11 基因枪法介导ODOI 转化蝴蝶石斛兰
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 矮牵牛花蕾RNA 的提取
• 3.3.2 RT-PCR
• 3.3.3 UBI- pTCK303-ODOI 植物表达载体的构建与鉴定
• 3.3.4 基因枪法介导ODOI 转化蝴蝶石斛兰原球茎的结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 香味相关基因的ODOI 克隆
• 3.4.2 基因枪介导的蝴蝶石斛兰遗传转化
• 3.4.3 香味基因的研究展望
• 4 结论
• 参考文献
• 缩写词及其英汉对照
• 附图:
• 致谢