水稻花器官发育关键基因PSD1的功能鉴定

论文摘要

psd1（pistil-stamen degeneration）是在台湾粳/圭630杂交F1花粉培养后代中发现的一个水稻花器官发育的突变体。psd1植株营养生长完全正常,与正常植株同步进入生殖发育,其颖花外型比正常颖花明显膨大,雄蕊原基和雌蕊原基不分化,产生多重内外稃结构（段远霖,2001）,推测PSD1是控制水稻花器官分化和形成的一个关键基因。对这个基因进行克隆和功能研究,对深入理解水稻花器官发育的分子机制具有重要意义。 通过精细定位,本研究室已获得PSD1候选基因,但必须进一步加以验证。本研究将来自psd1突变体的野生型等基因系（简称野生型）的PSD1候选基因分别转入psd1突变体和野生型及粳稻品种日本晴中,进行遗传互补和过量表达实验,以验证PSD1候选基因并研究其功能,探讨PSD1基因应用前景。主要结果如下: （1）克隆了PSD1候选基因完整的ORF,将其与组成型表达启动子——玉米泛素启动子（Ubi-1）连接,构建了pTCK303-PSD1双元表达载体。 （2）利用农杆菌介导,分别转化psd1突变体和野生型及日本晴,获得12株转基因植株,经PCR检测阳性率为58.3%。 （3）目前有11粒种子中的每一粒直接分化及对应转化得到的小绿苗超过10株。其中一粒种子成熟胚的愈伤分化出的5株植株全都是psd1突变体表型,其对应抗性愈伤已经分化出23株小绿苗和12个绿点。大约7月中下旬可以得到互补实验的田间表型鉴定结果。进一步的PCR检测、RT-PCR检测、Southern、Northern检测将有助于PSD1候选基因功能鉴定。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献综述
• 1 水稻花发育的研究进展
• 2 植物功能基因组学研究进展
• 材料与方法
• 1 实验材料与试剂
• 1.1 水稻材料
• 1.2 菌株
• 1.3 质粒载体
• 1.4 试验所用主要试剂及酶
• 1.5 测序和引物合成
• 1.6 试验所用主要仪器
• 1.7 培养基
• 1.7.1 水稻遗传转化培养基
• 1.7.2 菌类培养基
• 2 研究方法
• 2.1 PSD1野生型幼穗总RNA的提取
• 2.2 CTAB法基因组DNA的提取
• 2.3 总核酸提取质量的检测
• 2.4 cDNA目的片段的克隆、筛选鉴定及克隆载体构建
• 2.4.1 RT-PCR获得cDNA目的片段
• 2.4.2 cDNA目的片段的回收纯化
• 2.4.3 目的基因克隆载体构建
• 2.4.4 E coli感受态细胞的制备
• 2.4.5 目的片段的转化
• 2.4.6 用菌液做PCR快速检测阳性
• 2.4.7 E coli质粒DNA的提取
• 2.4.8 重组质粒的PCR及酶切鉴定分析
• 2.5 测序检测
• 2.6 植物表达载体的构建
• 2.6.1 含目的片段的pMD18-T-PSD1克隆载体DNA和pTCK303载体DNA的制备
• 2.6.2 载体和目的片段的获得
• 2.6.3 连接、转化及重组克隆的筛选与鉴定
• 2.7 植物双元表达载体pTCK303-PSD1冻融法导入根癌农杆菌LBA4404及EHA105及其鉴定
• 2.7.1 根癌农杆菌感受态细胞的微量制备
• 2.7.2 根癌农杆菌转化
• 2.7.3 农杆菌转化子的鉴定
• 2.8 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 2.8.1 水稻成熟胚的愈伤组织培养
• 2.8.2 水稻转化
• 2.9 抗性愈伤组织的分化及植株再生
• 2.10 转基因植株后代的鉴定
• 2.10.1 潮霉素基因鉴定转基因植株
• 2.10.2 转基因植株进一步的PCR鉴定
• 结果与分析
• 1 PSD1野生型幼穗总RNA的获得
• 2 PSD1基因cDNA片段的克隆和鉴定
• 3 植物表达载体的构建
• 3.1 含目的片段的pMD18-T-PSD1克隆载体和pTCK303载体的制备
• 3.2 载体和目的片段的获得
• 3.3 载体和目的片段的连接、转化及鉴定
• 4 植物双元表达载体pTCK303-PSD1冻融法导入根癌农杆菌LBA4404与EHA105及其鉴定
• 4.1 根癌农杆菌菌株的选择
• 4.2 根癌农杆菌转化子的鉴定
• 5 成熟胚胚性愈伤组织的诱导
• 6 转化及抗性愈伤组织的获得
• 7 转基因植株后代的鉴定
• 7.1 潮霉素基因鉴定转基因植株
• 7.2 转基因植株进一步的PCR鉴定
• 讨论
• 下一步工作计划
• 参考文献
• 附录 本实验所采用的培养基配方
• 致谢