论文摘要
目的从细胞分子水平,研究雷公藤红素诱导人类风湿关节炎纤维样滑膜细胞（FLS） DNA损伤、周期阻滞和凋亡作用机制,并探讨三者之间的关系,为雷公藤治疗类风湿关节炎提供实验基础和理论依据。方法1.雷公藤红素诱导FLS凋亡的作用及其机制研究雷公藤红素处理FLS24h后,MTT和LDH实验分别检测药物对FLS存活率和细胞毒性的影响；光学倒置显微镜观察细胞形态学的改变；DAPI染色观察细胞凋亡的发生及细胞核形态的典型凋亡特征：JC-1染色观察药物对FLS线粒体膜电位（△Ψm）的影响；Annexin V/PI双染实验利用流式细胞仪检测FLS早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率；western-blot检测FLS中与凋亡相关蛋白（Bcl-2, Bax, Caspase-3,9, PARP, Fas）含量的影响。2.雷公藤红素诱导FLS DNA损伤和G2阻滞的作用及其机制研究雷公藤红素处理FLS24h后,细胞周期实验利用流式细胞仪检测药物对FLS各细胞周期的影响；单细胞凝胶电泳观察药物对FLS DNA双链损伤影响；利用免疫荧光技术观察FLS中DNA损伤标志性蛋白γH2AX分布和含量的改变；western-blot检测FLS中与细胞周期和DNA损伤相关蛋白（Chkl、yH2AX、pCdc-25、pCdc-2、Cdc-2、Cyclin-bl）含量的影响。结果1.雷公藤红素作用24h后,FLS存活率明显下降,药物有效浓度为2μM,C50为4.9μM,呈剂量依赖型；FLS LDH漏出率显著增加,有效浓度为1μM,且与药物剂量正性相关,遂确定本次试验药物浓度为（0,1,2,5μM）；倒置显微镜下观察,细胞形态逐渐变圆、胞质浑浊,细胞核缩小；DAPI染色发现细胞核固缩,染色质凝集,蓝色荧光增强,细胞核出现典型凋亡特征；JC-1染色显示绿色荧光增强,红色荧光减弱；Annexin V/PI双染结果显示FLS凋亡率增加,且主要是由晚期凋亡引起的；western-blot显示Bay、Caspase-3,9、 PARP表达增加,Fas、Bcl-2含量降低。2.雷公藤红素作用24h后,细胞周期结果显示FLS被阻滞在G2期：彗星电泳结果说明FLS DNA受到损伤,且损伤程度与药物浓度正性相关；免疫荧光显示细胞核内yH2AX逐渐聚集并且含量增加；western-blot显示DNA损伤相关蛋白Chk1、γH2AX表达增加,周期相关蛋白pCdc-25、pCdc-2表达增加,Cdc-2、Cyclin-b1表达降低。结论1.雷公藤红素对FLS增殖有抑制作用。2.雷公藤红素诱导FLS发生凋亡,并拮抗FLS产生的凋亡抵抗。3.雷公藤红素诱导FLS阻滞在G2期。4.雷公藤红素造成FLS DNA的损伤。5.雷公藤红素FLS造成DNA损伤,使FLS阻滞在G2期,G2期DNA修复失败的细胞退出细胞周期,进入凋亡程序,最终产生对FLS增殖的抑制作用。