论文摘要
第一部分5-杂氮-2’-脱氧胞苷干预在香烟提取物腹腔注射所致小鼠肺气肿模型中的作用目的：探讨5-杂氮-2’-脱氧胞苷（AZA）干预对香烟提取物（CSE）腹腔注射所致小鼠肺气肿模型肺功能、支气管肺泡灌洗液（BALF）的细胞分类、肺气肿程度及肺泡间隔细胞凋亡的影响。方法：将40只BALB/C近交系雄性小鼠,按随机数字表法分为对照组、AZA组、CSE组、CSE+AZA干预组,每组各10只。CSE的制备用芙蓉牌香烟由抽吸装置进行连续抽吸燃烧,吸入的香烟经三通管进入PBS溶液（2ml中含1支烟）,制备成CSE-PBS溶液,每次使用前新鲜配置。对照组在第1、11、15、17、19、22天腹腔内注射PBS （0.3ml/20g）。AZA组在第1、11、22天腹腔内注射PBS（0.3ml/20g）,在第15、17、19天腹腔内注射AZA （2.5mg/kg/day）。 CSE组在第1、11、22天腹腔内注射CSE （0.3ml/20g）,在第15、17、19天腹腔内注射PBS （0.3ml/20g）。CSE+AZA干预组在第1、11、22天腹腔内注射CSE （0.3ml/20g）,在第15、17、19天腹腔内注射AZA （2.5mg/kg/day）。实验开始后第28天结束实验,处死小鼠。小动物肺功能仪进行肺功能测定,记录气道阻力（Raw）、动态肺顺应性（Cdyn）及呼气峰流速（PEF）等指标。用支气管肺泡灌洗术（BAL）收集支气管肺泡灌洗液（BALF）对其细胞成分进行计数和分类。肺组织病理切片苏木素-伊红（HE）染色后测定平均内衬间隔（MLI）和肺泡破坏指数（DI）评估肺气肿程度。TUNEL法测定肺泡间隔细胞凋亡并测定凋亡指数（AI）。使用SPSS13.0统计软件包进行数据分析,正态分布的各组计量资料以（x±s）表示,两组间均数比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:（1）CSE组小鼠气道阻力（RAW）较对照组增高[（0.212±0.012）cmH2O.mL-1. min-1vs.（0.069±0.005）cmH2O.mL-1. min-1,P<0.05], CSE组小鼠动态肺顺应性（Cdyn）较对照组降低[（0.109±0.006） mL/cmH2O vs.（0.217±0.010） mL/cmH2O,P<0.05]。 CSE+AZA干预组小鼠气道阻力（RAW）较CSE组降低[（0.072±0.005）cmH2O.mL-1·min-1vs.（0.212±0.012）cmH2O·mL-1. min-1P<0.05], CSE+AZA干预组小鼠动态肺顺应性（Cdyn）较CSE组升高[（0.162±0.006） mL/cmH2O vs.（0.109±0.006） mL/cmH2O,P <0.05]。AZA组小鼠气道阻力（RAW）较对照组增高[（0.115±0.009）cmH2O·mL-1.min-1vs.（0.069±0.005）cmH2O·mL-1. min-1,P<0.05], AZA组小鼠动态肺顺应性（Cdyn）较对照组降低,（0.131±0.005） mL/cmH20vs.（0.217±0.010） mL/cmH2O,,P<0.05]。（2）CSE组小鼠与对照组比较BALF中细胞总数[（4.86±0.52）×108/L vs.（1.58±0.24）×108/L]、巨噬细胞数（AM）[（3.26±0.32）×108/L vs.（1.21±0.16）×108/L]中性粒细胞数（N）[（7.56±0.89）×107L vs.（0.76±0.08）×107L]中性粒细胞所占比例[（13.01士2.12）%vs.（8.12±0.86）%]均增高（均P<0.05）。CSE+AZA干预组小鼠与CSE组比较BALF中细胞总数[（3.87±0.46）×108/L vs.（4.86±0.52）×108/L]、巨噬细胞数（AM）[（2.96±0.20）×108/L vs.（3.26±0.32）×108/L]中性粒细胞数（N）[（4.31±0.62）×107L vs.（7.56±0.89）×107L]中性粒细胞所占比例[（11.014±1.56）%VS.（13.01士2.12）%]均降低（均P<0.05）。AZA组小鼠细胞总数[（1.62±0.26）×108/L vs.（1.58±0.24）×108/L]、巨噬细胞数（AM）[（1.26±0.20）×108/L vs.（1.21±0.16）×108/L]、中性粒细胞数（N）[（0.78±0.11）×107L vs.（0.76±0.08）×107L]、中性粒细胞所占比例[（8.32±±0.91）%VS.（8.12±±0.86）%]较对照组无变化（均P>0.05）。（3）病理学观察显示对照组小鼠气道壁结构清楚,气道上皮排列整齐,未见明显上皮脱落。AZA组小鼠气道壁结构清楚,气道上皮排列整齐,少量炎性细胞浸润。而CSE组小鼠气道上皮排列紊乱、部分脱落、局部气道上皮增生、管壁增厚、管腔变小；气道周围大量炎症细胞浸润、部分气道周围肺泡等支撑结构缺失。CSE+AZA干预组小鼠气道上皮轻度排列紊乱、部分脱落、管腔稍变小；气道周围少量炎症细胞浸润。（4）病理学定量分析显示,CSE组小鼠与对照组比较平均内衬间隔（MLI）及肺泡破坏指数（DI）增高[（52.47±1.58）μm vs.（34.26±3.22） μm,（36.69±1.81）%vs.（11.85±3.12）%,均P<0.01]。CSE+AZA干预组小鼠与CSE组比较平均内衬间隔（MLI）及肺泡破坏指数（DI）降低[（40.04±1.76）μm vs.（52.47±1.58）μm,（22.55±1.43）%vs.（36.644±2.30）%,均尸<0.01]。AZA组小鼠较对照组比较平均内衬间隔（MLI）及肺泡破坏指数（DI）无差异[（34.36±3.46）μm vs.（34.26±3.22）μm,（13.96±3.31）%vs.（11.85±3.12）%,均P>0.01]。（5）肺泡间隔细胞凋亡结果显示CSE组小鼠肺泡间隔细胞凋亡率[（14.2±0.6）%]较对照组[（4.5±±0.6）%]增高（P<0.05）。CSE+AZA干预组小鼠肺泡间隔细胞凋亡率[（8.1±0.5）%]较CSE组[（14.2±±0.6）%]降低（P<0.05）。AZA组小鼠肺泡间隔细胞凋亡率（5.2±0.5）%较对照组肺泡间隔细胞凋亡率[（4.5±0.6）%]无差异（P>0.05）。结论：（1）腹腔内注射CSE能成功建立小鼠肺气肿模型。（2）腹腔内注射CSE所致小鼠肺气肿模型存在气道炎症、肺泡间隔细胞凋亡及肺阻力增加及动态肺顺应性下降。（3）AZA干预可部分抑制腹腔内注射CSE所致小鼠肺气肿模型气道炎症,改善腹腔内注射CSE所致小鼠肺气肿程度、降低肺阻力、增加动态肺顺应性、减轻肺泡间隔细胞凋亡。第二部分5-杂氮-2’.脱氧胞苷干预对香烟提取物腹腔注射所致小鼠肺气肿模型mtTFA、COX Ⅱ表达的影响目的：检测5-杂氮-2’-脱氧胞苷（AZA）干预对香烟提取物（CSE）腹腔注射所致小鼠肺气肿模型中肺组织mtTFA、COX Ⅱ的表达、COX活性的影响,分析它们与肺泡间隔细胞凋亡变化的关系,探讨mtTFA在小鼠肺气肿模型发病机制中的可能作用。方法：将40只BALB/C近交系雄性小鼠,按随机数字表法分为对照组、AZA组、CSE组、CSE+AZA干预组,每组各10只。收集各组小鼠肺组织标本,提取肺组织基因组DNA,分光光度法检测COX活性,普通RT-PCR和real-time RT-PCR检测mtTFA mRNA、COX Ⅱ mRNA表达,western-blot检测mtTFA、COX Ⅱ蛋白表达。使用SPSS13.0统计软件包进行数据分析,正态分布的各组计量资料以（x±s）表示,两组间均数比较采用独立样本t检验,变量间相关性分析采用单因素直线相关分析（Pearson）, P<0.05为差异有统计学意义。结果：（1）对照组小鼠肺组织mtTFA mRNA、mtTFA蛋白的相对表达量分别为（1.001±0.067）和（1.31±0.34）,AZA组小鼠肺组织mtTFA mRNA、mtTFA蛋白的相对表达量分别为（0.991±±0.34）和（1.30±0.06）,CSE组小鼠肺组织mtTFA mRNA、mtTFA蛋白的相对表达量分别为（0.5344±0.019）和（0.85±±0.04）,CSE+AZA干预组mtTFA mRNA、mtTFA蛋白的相对表达量分别为（0.723±±0.055）和（1.144±0.06）。CSE组小鼠肺组织mtTFA mRNA、mtTFA蛋白表达均较对照组明显下降[（0.5344±0.019）vs.（1.001±0.067）,（（0.85±0.04）vs.（1.31±0.34）,均P<0.01]; CSE+AZA干预组mtTFA mRNA、mtTFA蛋白表达均较CSE组升高[（0.723±0.055）vs.（0.534±0.019）,（1.14±0.06）vs.（0.85±0.04）,均P<0.01]; AZA组mtTFA mRNA、mtTFA蛋白表达较对照组无差异[（0.991±0.34）vs.（1.001±0.067）,（1.30±0.06）vs.（1.31±0.34）,均P>0.01]。（2）对照组小鼠肺组织COX活性、COX Ⅱ mRNA、COX Ⅱ蛋白的相对表达量分别为[（6.5±0.3）×10-1]U/mg、（1.000±0.024）和（2.99±0.13）,AZA组小鼠肺组织COX活性、COX Ⅱ mRNA、COXⅡ蛋白的相对表达量分别为[（6.2±0.5）×10-1]U/mg、（1.009±0.024）和（2.96±0.15）,CSE组小鼠肺组织COX活性、COX Ⅱ mRNA、COXⅡ蛋白的相对表达量分别为[（4.2±0.4）×10-1]U/mg、（0.678±0.045）和（0.89±0.13）, CSE+AZA干预组COX活性、COX Ⅱ mRNA、COXⅡ蛋白的相对表达量分别为[（5.1-0.5）×10-1]U/mg、（0.837±0.010）和（2.71士0.18）。CSE组肺组织COX活性、COX Ⅱ mRNA和COX Ⅱ蛋白表达均较对照组明显下降[（4.2±0.4）×10-1]U/mg vs.（6.5±0.3）×10-1]U/mg,（0.678±0.045） vs.（1.000±0.024）,（0.89±0.13） vs.（2.99±0.13）（P<0.01,P<0.01,P<0.01）];, CSE+AZA干预组肺组织COX活性、COX Ⅱ mRNA和COX Ⅱ蛋白表达均较CSE组明显升高[（5.1±0.5）×10-1]U/mgvs.（4.2±0.4）×10-1]U/mg,（0.837±0.010）vs.（0.678±0.045）,（2.71±0.18）vs.（0.89±0.13）（P<0.01,P<0.01,P<0.01）]; AZA组肺组织COX活性、COX Ⅱ mRNA和COX Ⅱ蛋白表达较对照组比较无差异[（6.2±0.5）×10-1]U/mg vs.（6.5±0.3）×10-1]U/mg,（1.009±0.024） vs.（1.000±0.024）,（2.96±0.15） vs.（2.99±0.13）均P>0.01）]。（3）相关分析显示肺泡间隔细胞的凋亡率与动态肺顺应性均呈负相关（r=-0.787,P<0.01）；肺泡间隔细胞凋亡率与肺阻力呈正相关（r=0.726,P<0.01）；肺组织COX活性与肺泡间隔细胞凋亡指数呈负相关（r=-0.796,P<0.01）；肺组织mtTFA蛋白表达与COX Ⅱ蛋白表达、COX活性呈正相关（r=0.889,r=0.826,均P<0.01）,与肺泡间隔细胞凋亡率呈负相关（r=-0.758,P<0.01）。结论：（1）肺气肿小鼠肺组织mtTFA、COX Ⅱ表达下降,COX活性下降。（2）CSE可能通过抑制mtTFA表达,从而影响COX活性而参与肺气肿小鼠肺泡间隔细胞凋亡。（3）AZA干预作用下mtTFA、COX Ⅱ表达上调,从而影响COX活性而减少肺气肿小鼠肺泡间隔细胞凋亡。第三部分5-杂氮-2’-脱氧胞苷干预对香烟提取物腹腔注射所致小鼠肺气肿模型mtTFA基因甲基化及肺组织基因组总体甲基化的影响目的：检测5-杂氮-2’-脱氧胞苷（AZA）干预对香烟提取物（CSE）腹腔注射所致小鼠肺气肿模型中mtTFA基因启动子区甲基化及肺组织基因组总体甲基化的影响,探讨mtTFA基因甲基化在小鼠肺气肿模型中的可能作用。方法：将40只BALB/C近交系雄性小鼠,按随机数字表法分为对照组、AZA组、CSE组、CSE+AZA干预组,每组各10只。收集各组小鼠肺组织标本,提取肺组织基因组DNA,亚硫酸氢钠基因组测序法（BSP）检测mtTFA基因启动子区甲基化程度,高效液相色谱法检测肺组织基因组总体甲基化的程度。用SPSS13.0统计软件包进行数据分析,计量数据用（x±s）表示,多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。结果：（1）BSP发现CSE组mtTFA基因启动区有多个甲基化CpG位点,平均甲基化率为（9.40±0.66）%,较CSE+AZA组mtTFA基因启动区平均甲基化率（3.50±2.41）%高（P<0.05）。而对照组、AZA组mtTFA基因启动区未发现甲基化CpG位点。（2）肺组织基因总体甲基化率在对照组、AZA组、CSE组、CSE+AZA组分别为5.219±0.115%、4.916±0.156%、6.317±0.102%、5.412±0.135%,CSE组肺组织基因总体甲基化率较对照组、AZA组、CSE+AZA组高[（6.317±0.102%）vs.（5.219±0.115%）,（6.317±0.102%） vs.（4.916±0.156%）,（6.317±0.102%）vs.（5.412±0.135%）均P<0.05]。结论：（1）CSE可能通过诱导mtTFA甲基化而下调mtTFA表达,从而抑制COX Ⅱ表达和COX活性,导致肺泡间隔细胞凋亡增加。)（2）AZA可能通过抑制mtTFA甲基化而上调mtTFA表达,从而上调COX Ⅱ表达和COX活性,减少肺泡间隔细胞凋亡。