丽格海棠遗传转化及离体诱变体系的研究

论文摘要

丽格海棠（Rieger Begonia），又称玫瑰海棠，属秋海棠科秋海棠属的多年生草本花卉。因其花色艳美、花型多样、花朵硕大、花期特长，尤其是在春节开花，深受市场的欢迎。目前，最好的丽格海棠盆花仍以进口为主，但由于丽格海棠不耐运输，长时间运输不仅使丽格海棠折断受损情况普遍发生，而且对叶片的形状、花的形态也会造成很大的影响，导致观赏效果的严重下降；同时，丽格海棠存在生长周期长，抗病性差和栽培难度大等缺点，因此，在国内对丽格海棠进行品种的遗传改良，加强其繁殖和栽培技术的研究已迫在眉睫。本研究以丽格海棠叶片和叶柄为外植体，通过对不同激素浓度的筛选，构建了丽格海棠的受体再生系统，在此基础上，初步建立了丽格海棠的遗传转化体系和EMS离体诱变体系，为丽格海棠品种改良奠定坚实基础。研究结果如下：1、优化了丽格海棠的高效再生体系，为后期的遗传转化、离体诱变奠定了坚实的基础。它们分别是：MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05mg/L+KT0.1mg／+蔗糖3％+琼脂0.7％pH6.0（最适生芽培养基），其生芽率为95％，且平均有效芽数高达17.87；1／2MS+IBA0.2mg／L+NAA0.15mg／L+蔗糖3％+琼脂0.7％pH6.0（最适生根培养基），生根率为100％，且小苗生长壮实。2、研究了丽格海棠外植体对抗生素的敏感性。试验结果表明：Km=100mg/L能完全抑制丽格海棠叶片外植体的再生，而半抑制剂量则为Km=25～50 mg/L；当Cef＞250 mg/L时，其对丽格海棠叶片外植体的再生有一定的影响。3、初步构建了丽格海棠的遗传转化体系。利用根癌农杆菌EHA52将目的基因cycd2转入丽格海棠受体中，T0代愈伤组织的PCR和Southern杂交分析证明cycd2基因已整合到丽格海棠基因组中。4、建立了丽格海棠EMS离体诱变技术体系。本试验研究了EMS的处理时间、处理浓度和处理温度对丽格海棠叶片外植体离体再生的影响，结果表明：EMS=0.4％（8h，20℃）为丽格海棠叶片外植体再生的半抑制剂量，该浓度适合诱变处理。5、获得了不同类型的变异植株。通过EMS对丽格海棠进行离体诱变，在M0代中筛选出21株在形态上表现出变异的植株，通过对这些变异植株的RAPD分析，有12株的电泳条带表现出多态性，进一步证明这些变异是发生在分子水平上的。6、探讨了变异的遗传稳定性及嵌合变异体的分离，对12个在基因组上表现出变异的植株进行离体培养，在M2代分离出嵌合体变异，并鉴定出有7个变异是可以遗传的，有4个变异不能遗传，还有一个在继续观察之中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 秋海棠属植物概况
• 2. 丽格海棠的生产状况和前景
• 3. 我国花卉育种的历史、现状及研究进展
• 4. 转基因技术在花卉育种中应用的研究进展
• 5. 农杆菌介导转基因技术在植物育种中的原理及应用
• 6. 花卉目的基因的研究
• 6.1 与花色有关的基因
• 6.2 与花型有关的基因
• 6.3 与花期有关的基因
• 6.4 与花卉衰老相关的基因
• 7. 植物细胞周期蛋白基因
• 7.1 植物细胞周期蛋白基因
• 7.2 依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶基因
• 8. 花卉诱变育种
• 8.1 我国诱变育种的发展概况
• 8.2 诱变育种技术及处理方法
• 9. 化学诱变技术
• 9.1 化学诱变育种研究的进展
• 9.2 化学诱变剂的种类及诱变机理
• 9.3 EMS在植物育种中的应用
• 10. 研究目的和意义
• 11 研究思路
• 第二章 丽格海棠受体系统的建立
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 试验结果
• 2.1 生芽培养
• 2.2 不定芽的生根
• 2.3 炼苗与移栽
• 3. 讨论
• 3.1 激素的影响
• 3.2 外植体的选择
• 3.3 生根培养与炼苗
• 4. 小结
• 第三章 丽格海棠转化cycd2基因的初步研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种和质粒
• 1.3 各种试剂盒
• 1.4 常用储存液及配法
• 1.5 生化试剂与配置
• 1.6 培养基
• 2. 方法
• 2.1 质粒pBI121-cycd2转化根癌农杆菌EHA52
• 2.2 丽格海棠再生系统的建立
• 2.3 抗生素敏感性实验
• 2.4 Cycd2基因共培养转化丽格海棠
• 2.5 转化体的检测
• 3. 结果
• 3.1 pBI121-cycd2质粒转化农杆菌
• 3.2 根癌农杆菌生长曲线的测定
• 3.3 抗生素敏感性实验
• 3.4 外植体预培养时间对出愈率的影响
• 3.5 共培养时间对Km抗性芽分化的影响
• 3.6 Km抗性丽格海棠的筛选培养
• 3.7 丽格海棠叶片总DNA的提取
• 3.8 丽格海棠转化体的PCR检测
• 3.9 丽格海棠转化体的Southern杂交分析
• 4. 讨论
• 4.1 基因转化目的
• 4.2 选择压力的确定
• 4.3 脱菌剂的使用
• 4.4 转化效果及存在的问题
• 5. 小结
• 第四章 EMS对丽格海棠离体诱变的生物学效应
• 1. 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 常用储备液
• 1.4 溶液的配置
• 2. 方法
• 2.1 外植体的处理及成苗
• 2.2 最适处理时间的选择
• 2.3 数据的收集及处理
• 2.4 RAPD体系条件优化
• 2.5 变异植株的筛选
• 2.6 嵌合体的分离及变异后代的遗传稳定性鉴定
• 3 结果
• 3.1 最适处理时间的选择
• 3.2 不同浓度EMS对外植体诱导和成苗的影响
• 3.3 RAPD体系条件优化
• 3.4 EMS处理后变异的情况
• 3.5 变异株系的RAPD检测
• 3.6 嵌合体的分离及变异后代的遗传稳定性鉴定
• 4. 讨论
• 4.1 EMS诱变的有效性
• 4.2 RAPD在植物诱变育种中的应用
• 4.3 嵌合突变体的分离
• 5. 小结
• 参考文献
• 附录 攻读学位期间发表的学术论文
• 图版说明
• 致谢