纤维素降解菌的筛选和纤维素酶基因的克隆表达

论文摘要

纤维素是地球上含量最多的可再生资源,然而由于一些关键技术瓶颈造成了纤维素资源没有得到充分的利用,并且由于纤维素的燃烧、堆积等造成了环境的污染。随着资源的紧张、对环境问题的重视,人们对纤维素酶研究的投入也在加大。我们希望通过我们的力量,对纤维素酶的基础研究能够做出一定的贡献。本研究先通过摸索建立了适合本研究的纤维素降解菌的筛选模型,并利用此模型筛选出了9株纤维素降解真菌,经过滤纸条崩解实验和cellulose-azure降解实验复筛,最后得到了2株降解纤维素比较好的纤维素降解菌。通过分子生物学的方法,对这2株纤维素降解菌进行的鉴定。PCR扩增菌株的18SrDNA,进行序列的比对和系统进化树的构建。经过鉴定这2株菌分别为紫青霉（Penicillium purpurogenum）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。并对这2株菌所产的纤维素酶的酶学性质进行了初探,测定酶活、温度和PH值对酶学性质的影响。这2株真菌的内切酶活性在液体培养基发酵条件下的酶活性分别为1.06IU、0.81IU,外切酶活性0.71IU、0.19IU。通过实验发现烟曲霉纤维二糖酶可以耐受70℃的高温,在酸性条件下可以起作用基本上可以看作是在极端条件下能够起作用的酶。紧接着,我们克隆了烟曲霉纤维二糖水解酶CBH基因到PET28（a）表达载体上。并转入到大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。通过SDS-PAGE电泳分析,获得52KDa表达蛋白,与所预测的蛋白大小相符合。对纯化蛋白的酶学活性进一步研究表明,烟曲霉纤维二糖酶最适pH值为4到6,最适温度为70℃。在80C保持一个小时的条件下,酶活性依然可以保持80%以上。所以,烟曲霉纤维二糖酶属于极端条件下能够起作用的酶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 本课题的研究背景及目的意义
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究的目的和意义
• 1.2 国内外纤维素酶研究的现状
• 1.2.1 纤维素酶的组成和分类
• 1.2.2 纤维素酶的结构和功能
• 1.2.3 纤维素酶的理化特性
• 1.2.4 纤维素酶的基因工程和蛋白质工程
• 1.2.5 能产纤维素酶的微生物
• 1.2.6 纤维素酶的作用机理
• 第二章 纤维素降解菌的筛选
• 2.1 原料和试剂
• 2.1.1 原料
• 2.1.2 试剂及配制
• 2.1.3 菌株的来源
• 2.1.4 培养基组成
• 2.2 方法
• 2.2.1 稀释涂布平板分离纤维素降解菌
• 2.2.2 土壤中的菌经过富集培养进行初筛、复筛分离
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 筛选实验结果
• 2.3.2 滤纸条崩解实验和cellulose-azure实验
• 2.4 本章小结
• 第三章 纤维素降解菌的鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株来源:本实验筛选到的株菌株以及本实验中保存的菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 其它试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌株的形态鉴定
• 3.2.2 真菌基因组DNA的提取
• 3.2.3 18SrDNA基因的扩增
• 3.2.4 18srDNA的测序
• 3.2.5 18SrDNA系统发育树的构建
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 菌丝体的形态
• 3.3.2 分离菌株的18s PCR图
• 3.3.3 18srDNA测序比对结果结果
• 3.3.4 基于18srDNA序列系统发育树的构建
• 3.4 本章小结
• 第四章 酶学性质的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂及配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌株孢子悬液的制备
• 4.2.2 酶活性测定
• 4.2.3 温度对酶活性的影响
• 4.2.4 PH值对酶活性的影响
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 酶活测定结果
• 4.3.2 温度对酶活性的影响
• 4.3.3 温度对纤维素酶活性的影响
• 4.4 本章小结
• 第五章 纤维素酶基因的克隆与表达
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 主要试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 引物的设计
• 5.2.2 PCR扩增1、2、3三个片段及三个片段的链接
• 5.2.3 重组质粒PET.His-CBH的构建
• 5.2.4 目的基因的诱导表达
• 5.2.5 SDS-PAGE分析
• 5.2.6 纤维素酶的纯化
• 5.2.7 酶学性质分析
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 引物设计和PCR扩增目的片段
• 5.3.2 测序结果与文献报道中的序列进行比较
• 5.3.3 表达载体Pet.His-CBH的构建
• 5.3.4 SDS-PAGE分析
• 5.3.5 蛋白的纯化
• 5.3.6 酶学性质分析
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 攻读硕士论文期间发表的文章
• 致谢