谷氨酸/胱氨酸转运体调控细胞增殖的作用及氧化应激对其的影响

论文摘要

神经胶质瘤细胞主要依赖谷氨酸/胱氨酸转运体（glutamate/cystine antiporter, xc-）摄取胱氨酸合成谷胱甘肽（GSH）,维持细胞的抗氧化能力。本研究以神经胶质瘤C6细胞、原代培养的星形胶质细胞和常常被作为神经元模型的嗜铬细胞瘤PC-12细胞为研究对象,观察谷氨酸/胱氨酸转运体抑制剂—柳氮磺吡啶（SAS）对三种细胞存活率的影响,进一步探讨不同类型的氧化剂对SAS抑制细胞增殖作用的影响及其机制,通过分析谷氨酸/胱氨酸转运体在肿瘤形成中的作用,为神经胶质瘤的治疗提供理论基础。本实验证明了相对于原代培养的星形胶质细胞和神经元,谷氨酸/胱氨酸转运体抑制剂SAS对C6细胞增殖的抑制作用较强,呈剂量依赖性,表明SAS对C6细胞增殖具有特异性的抑制作用。其次,SAS分别与维生素K3（VK3）或过氧化氢（H2O2）同时添加,通过以下机制抑制细胞增殖:（1）使xCT表达降低,内源性导致合成GSH的原料—胱氨酸缺乏;（2）通过使C6细胞内活性氧增多,外源性导致细胞内原有的GSH进一步消耗增多;（3）抑制GSH合成的限速酶—谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）亚单位GCLC、GCLM的表达,内源性导致C6细胞内新的GSH合成受限,引起C6细胞内的GSH含量下降;（4） SAS分别与VK3、H2O2同时添加,C6细胞IκB-α表达的变化与参与降解IκB-α的E3泛素-蛋白连接酶（β-trcp）表达趋势相一致,表明在此过程中IκB-α的变化可能与泛素-蛋白酶体途径无关;（5） SAS分别与VK3、H2O2同时添加虽然细胞核内NF-κB（p65）蛋白表达增高,但其p65蛋白总体水平和靶基因细胞周期素D1（Cyclin D1）的mRNA水平下降,细胞增殖被抑制。提示在p65蛋白总体水平下降的情况下,其核内蛋白水平的增加,并不足以使p65的活性增强,细胞NF-κB（p65）总体与核内蛋白水平之间的平衡可能影响了NF-κB（p65）的活性。可见,GSH/NF-κB途径是氧化应激增强SAS抑制细胞增殖的作用机制之一。同时发现不同的氧化剂对SAS抑制C6细胞增殖的作用存在着不同的影响:（1） SAS与VK3同时添加能够抑制C6细胞EAAT3的表达,使C6细胞从细胞外摄取谷氨酸减少,导致细胞外谷氨酸浓度增高,从而抑制了xc-转运体的功能,导致细胞摄取胱氨酸减少;（2） SAS与VK3同时添加细胞IκB-α、β-trcp mRNA水平逐渐下降,而SAS与H2O2同时添加时最终导致IκB-α、β-trcp mRNA水平明显升高,推测IκB-α和泛素-蛋白酶体途径在VK3和H2O2对SAS抑制C6细胞增殖的影响中发挥了不同的作用;（3） SAS与VK3同时添加能够影响线粒体CLIC4和14-3-3γ的表达,进而推测可能是通过影响14-3-3与CLIC4蛋白的结合引起细胞死亡;而SAS与H2O2同时添加主要是通过线粒体通路中Bax/Bcl-2途径,导致细胞死亡。这些差异可能是导致SAS与VK3同时添加能够引起C6细胞坏死,而与H2O2同时添加则主要引起细胞凋亡的机制之一。综上所述,本实验通过观察氧化应激对谷氨酸/胱氨酸转运体调控细胞增殖作用的影响,结果表明谷氨酸/胱氨酸转运体在通过GSH/NF-κB/线粒体途径调控细胞增殖中发挥了极其重要的作用,进一步揭示了谷氨酸/胱氨酸转运体作为临床治疗神经胶质瘤靶点的可能机制。氧化剂可以增强谷氨酸/胱氨酸转运体抑制剂的治疗效果,减少各自的药物毒副作用。对比SAS与VK3或H2O2联合应用的机制,提示VK3作为一种复合物,除了氧化应激作用以外,还可能具有其他的药理作用,进一步探讨其作用机制能够为临床治疗神经胶质瘤提供一新的作用靶点。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩略词表
• 前言
• 第1章 文献综述
• 1.1 谷氨酸/胱氨酸转运体与柳氮磺吡啶
• 1.2 氧化应激对细胞增殖的影响
• 1.3 谷胱甘肽在细胞抵抗氧化应激中的作用
• 1.4 核因子 κB与细胞增殖
• 1.5 氯通道家族及CLIC4
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 第3章 实验结果
• 3和H₂O₂对C6 细胞增殖的影响'>3.1 不同浓度SAS、VK₃和H₂O₂对C6 细胞增殖的影响
• 3和H₂O₂对原代培养的星形胶质细胞增殖的影响'>3.2 不同浓度SAS、VK₃和H₂O₂对原代培养的星形胶质细胞增殖的影响
• 3和H₂O₂对PC-12 细胞增殖的影响'>3.3 不同浓度SAS、VK₃和H₂O₂对PC-12 细胞增殖的影响
• 3.4 TUNEL 法检测细胞凋亡
• 3.5 LDH 测定结果
• 3.6 细胞内GSH 含量的测定
• 3与H₂O₂作用于C6 细胞4H时细胞内ROS 水平'>3.7 DCFH-DA 法检测SAS、VK₃与H₂O₂作用于C6 细胞4H时细胞内ROS 水平
• 3与H₂O₂作用于C6 细胞后不同时间点XCT、GCLC、GCLM、EAAT3 mRNA水平的变化'>3.8 SAS、VK₃与H₂O₂作用于C6 细胞后不同时间点XCT、GCLC、GCLM、EAAT3 mRNA水平的变化
• 3与H₂O₂作用于C6 细胞4H时NF-ΚB（P65）蛋白在细胞内表达定位情况'>3.9 免疫细胞化学染色法检测SAS、VK₃与H₂O₂作用于C6 细胞4H时NF-ΚB（P65）蛋白在细胞内表达定位情况
• 3与H₂O₂作用于C6 细胞后不同时间点IΚB-Α、Β-TRCP、CyclinD1 的 mRNA 水平和 NF-κB（p65）蛋白表达的变化'>3.10 SAS、VK₃与H₂O₂作用于C6 细胞后不同时间点IΚB-Α、Β-TRCP、CyclinD1 的 mRNA 水平和 NF-κB（p65）蛋白表达的变化
• 3与H₂O₂作用于C6 细胞后不同时间点BCL-2、BAX MRNA 水平和蛋白表达的变化'>3.11 SAS、VK₃与H₂O₂作用于C6 细胞后不同时间点BCL-2、BAX MRNA 水平和蛋白表达的变化
• 3与H₂O₂作用于C6 细胞后不同时间点CLIC4 MRNA、蛋白和14-3-3Γ蛋白表达的变化'>3.12 SAS、VK₃与H₂O₂作用于C6 细胞后不同时间点CLIC4 MRNA、蛋白和14-3-3Γ蛋白表达的变化
• 第4章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表文章
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT