论文摘要
目的近年来,肺癌的发病率逐年上升。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌所有病例的80%以上。由于常发生远处转移,肺癌患者的5年生存率只有15%左右。虽然大多数肿瘤是单克隆起源的,但由于肿瘤的遗传学不稳定性和靶器官的选择作用,肿瘤常常表现为一个不断变异的群体,有些瘤细胞亚群得以杂在靶器官优势生长,获得转移表型。在这个过程中,有大量基因的表达发生着改变。与原发瘤细胞相比,一部分癌细胞可能被赋予一些特殊的生物学性状而具有非凡的转移能力。寻找这些差异表达的基因,对于阐明肿瘤转移的发生机制,乃至设计相应的阻断靶点,最终抑制转移,具有十分重要的理论意义及临床应用前景。本实验利用稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的人巨细胞肺癌细胞株95D,建立肺癌裸鼠皮下移植及肺转移模型,用荧光激活的流式细胞分选术（fluorescence-activated cell sorting ,FACS）分别纯化原发灶和肺部转移灶癌细胞,利用近年来迅速发展的一种快速分析基因表达信息的技术---基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression,SAGE）,从全基因组水平对裸鼠肺癌转移模型皮下原发灶和肺部转移灶的癌细胞的基因表达谱进行比较和分析,为寻找在肺癌转移过程中发生改变的基因做出尝试,为进一步研究肺癌转移机制打下基础。方法1.利用逆转录病毒将GFP导入人高转移肺癌细胞株95D,经过G418筛选和克隆化培养,用荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP基因在癌细胞体外的表达,绘制细胞生长曲线,检测细胞贴壁率等,观察稳定表达GFP的癌细胞的细胞生物学行为有无改变。2. 95D/GFP-1细胞接种裸鼠背部皮下,成瘤2月后,常规麻醉裸鼠,荧光体视镜结合解剖观察皮下原发灶肿瘤及远处脏器,寻找转移病灶,并利用FACS法纯化病灶肿瘤细胞。3.利用SAGE技术,建立皮下原发病灶和肺部转移病灶肿瘤细胞表达序列标签（expression sequence tags,EST）文库,对照美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnolgy Information,NCBI）的SAGEMAP数据库,获得对应基因,比较两个文库寻找差异基因。结果1.携带GFP的逆转录病毒有效感染95D细胞,筛选出一株能稳定、高效、持久地表达GFP且生物学特性无明显改变的细胞株95D/GFP-1。2. 95D/GFP-1接种至裸鼠皮下后,2周左右成瘤,2月后可发生淋巴结、肺部、肝脏的自发性转移。皮下肿瘤原发病灶在荧光体视镜下可清晰观察到肿瘤侵犯范围及周边血管生长情况,裸鼠大体解剖后可观察到转移淋巴结和肺脏转移灶肿瘤细胞的GFP表达。3. FACS法纯化皮下原发灶及肺部转移灶肿瘤细胞,利用SAGE技术,皮下原发灶共获得长标签5420个,肺部转移灶共获得长标签5016个。通过比较两个文库中标签序列特性及对应基因,以差异在4倍以上为标准,在转移灶中获得了20个下调基因和33个上调基因。结论1.稳定表达GFP的人高转移肺癌细胞株95D/GFP-1的建立为实时观察和示踪肺癌侵袭和转移的发生提供了理想的细胞株。2. 95D/GFP-1皮下接种BALB/C裸鼠可在肝脏、肺部和淋巴结形成转移灶,成功构建了人肺癌细胞株自发转移模型。3.成功建立了人肺癌细胞株皮下原发灶和肺部转移灶两个SAGE文库,通过比较获得了差异表达基因共53个,肿瘤获得转移潜能可能与这些基因表达改变有关。并拟继续深入研究这些基因在肺癌转移过程中的作用。
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标签：绿色荧光蛋白论文; 肺癌论文; 肿瘤转移论文; 基因表达系列分析论文; 差异基因论文;