论文摘要
腱/韧带是坚韧的结缔组织,通过其结构、力学性质和外形的变化以响应外力的刺激,在运动中起着重要作用,但活动范围超过极限或拉扯过剧,腱/韧带都会受到损伤甚至断裂,严重影响人们的健康。腱/韧带损伤的治疗目前仍然是整形外科中具有挑战性的问题,比如如何加快治疗速度、提高治疗质量直至完全治愈等等,都是临床上亟待解决的难题。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是一类具有增殖和多分化潜能的特殊细胞。在特异诱导条件作用下,骨髓间充质干细胞在体外可增殖并定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞等,这种分化可塑性为弥补临床上腱/韧带组织的缺乏和腱/韧带创伤的愈合带来了希望,但对于胞外基质是否能诱导骨髓间充质干细胞向腱/韧带成纤维细胞定向分化以及分化的适宜条件,至今尚没有系统研究报道。为此,本文以大鼠骨髓间充质干细胞（Rat marrow mesenchymal stem cells, rMSCs）为研究对象,采用肌腱细胞胞外基质的主要成分I型胶原蛋白（Collagen I）和弹性蛋白（Elastin）分别对骨髓干细胞进行诱导培养,考察了Collagen I和Elastin诱导大鼠骨髓干细胞向腱/韧带成纤维细胞定向分化的条件。主要研究工作和结果如下:1.大鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养利用密度梯度离心结合差异贴壁法进行大鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养,结果表明:1.073g/ml的percoll密度梯度离心结合差异贴壁分离得到的细胞为形态比较均一的单核细胞,用含15%胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）的DMEM培养基培养24小时后细胞开始贴壁,继而分裂增殖,呈集落式生长,约2周后细胞接近融合,呈纺锤形或长梭形的成纤维细胞样形态。其间有漂浮不贴壁的造血细胞等,在反复换液中被除去。传代细胞贴壁、生长较快,约一周可达到融合,呈长梭形或纺锤形均匀分布。细胞核浆比较大,姬姆沙染色胞核呈圆形或椭圆形,为紫色,可见数个深紫色的核仁,胞浆为淡紫色。2.大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定和周期分析利用免疫染色方法考查了分离培养的细胞表面部分抗原的表达,利用流式细胞技术分析了细胞周期的分布。结果发现:细胞表面抗原CD34（造血干细胞标记物）呈阴性;CD44和CD29呈阳性表达。细胞周期分析显示G0/G1期细胞占（89.74±3.87）%,S期细胞占（2.49±2.2）%,G2/M期细胞占（7.7±3.7）%,表明大部分细胞处于非增殖状态。3. Collagen I对大鼠骨髓间充质干细胞定向分化的诱导考查了不同浓度的Collagen I对大鼠骨髓干细胞选择分化的诱导作用,利用RT-PCR技术定量检测了诱导7天、14天和21天过程中Collagen I、Collagen III和腱/韧带成纤维细胞特异标志基因Scleraxis mRNA水平的表达。结果表明:不同浓度Collagen I诱导细胞分化7天Collagen I、Collagen III都有不同程度的表达,而Scleraxis的表达并不明显。诱导14天后Collagen I、Collagen III和Scleraxis相对表达量出现一个峰值,21天后表达量又开始呈现下降趋势。比较而言,100μg/ml的Collagen I诱导14天,Collagen I、Collagen III和Scleraxis mRNA水平的表达呈现较高的水平。4. Elastin对大鼠骨髓间充质干细胞定向分化的诱导采取同样的方法考查了不同浓度的Elastin对大鼠骨髓间充质干细胞选择分化的诱导作用。结果表明: Elastin刺激rMSCs 7天后Collagen I、Collagen III有少量表达。与Collagen I诱导有所不同的是,作用7天后Scleraxis就开始表达,作用14天后各个基因的相对表达量达到最大,作用21天后表达量出现下调。20μg/mL Elastin的诱导效果相对较好,作用效果更为明显。本文研究结果表明,胞外基质Collagen I和Elastin对大鼠骨髓间充质干细胞的选择分化起着重要的调节作用,在适宜条件下可诱导骨髓间充质干细胞向腱/韧带成纤维细胞定向分化。这些研究不仅对认识骨髓间充质干细胞自我更新、分化的分子调控机制及其相关规律有重要意义,而且为腱/韧带损伤的临床治疗和腱/韧带的组织工程化研究提供了理论参考和方法学借鉴。