论文摘要
目的（1）探讨维生素C体外诱导低分化胃癌细胞株MKN45凋亡的能力,（2）探讨氧化应激机制在维生素C诱导人胃癌MKN45细胞凋亡中的作用,（3）探讨维生素C诱导胃癌细胞株MKN45凋亡的可能相关机制。方法1、在体外培养的胃癌MKN45细胞株中加入不同浓度的维生素C（0.05mg/ml?0.1mg/ml?0.5mg/ml?1mg/ml?1.5mg/ml）,并用H2O2特异性抑制剂过氧化氢酶单独和与能诱导MKN45细胞凋亡剂量的维生素C联合作用于MKN45细胞,通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法绘制细胞生长曲线,观察维生素C对细胞生长活力的影响;应用荧光显微镜、Annexin V FITC/PI双染流式细胞术、DNA Ladder分析法检测细胞凋亡情况;应用化学显色法测定维生素C作用MKN45细胞株24h后细胞内氧化应激指标SOD活性、MDA含量的变化。用H2O2检测试剂盒检测DMEM培养基中H2O2水平。2、应用分光光度法检测维生素C和过氧化氢酶作用前后MKN45细胞中Caspase-3活性的改变,RT-PCR法检测维生素C和过氧化氢酶作用前后MKN45细胞中Caspase-3基因、BCL-2基因家族mRNA表达水平的变化。结果:1、维生素C浓度在0.05mg/ml～0.5mg/ml之间,分别作用12、24、36小时后,MKN45细胞生长抑制率呈浓度依赖性,但生长抑制作用并不显著,且无明显时间依赖性。1mg/ml浓度的维生素C作用于胃癌MKN45细胞24小时后,可诱导MKN45凋亡,流式细胞术检测其凋亡率为31.4%,明显高于加入完全培养液的对照组凋亡率2.3% （P<0.001）,并呈现凋亡的形态学改变,DNA Ladder分析呈典型“梯状”条带。1mg/ml维生素C培养基组,完全培养基对照组,200u /ml过氧化氢酶培养基组,维生素C加过氧化氢酶培养基组中所含H2O2浓度分别为:0.0317±0.0031,0.0063±0.0002 ,0.0060±0.0008,0.0067±0.0005 mmol / L,1mg/ml维生素C培养基组H2O2浓度明显高于对照组（ P < 0. 05）。用过氧化氢酶（catalase）200 u /ml干预后,维生素C抑制MKN45细胞生长的作用明显减弱,细胞凋亡率由31.4%下降为6.3% （ P < 0. 05）。维生素C处理组SOD活性为272.00±31.77u/ml,对照组SOD活性为1224.00±52.32 u/ml,与对照组相比,细胞内的SOD活性明显下降（ P < 0. 05）,而维生素C处理组代谢产物MDA含量为80.00±13.06nmol/ml,对照组MDA含量为1.81±0.076nmol/ml,与对照组MDA相比,MDA明显增加（ P < 0. 05）。2、1mg/ml浓度的维生素C作用MKN45细胞24小时后,RT-PCR结果显示可诱导BAD基因表达明显增加及诱导BCL-2基因表达明显减弱,用过氧化氢酶干预后,维生素C诱导的BAD基因表达未见明显增加,而BCL- 2基因表达也未见明显减弱（第二部分图1A）。1mg/ml浓度的维生素C作用MKN45细胞24小时后,未见BAX基因和BCL- XL基因表达的明显变化。用过氧化氢酶干预后的处理组和过氧化氢酶联合维生素C的处理组Caspase-3活性分别为0.0971±0.0025,0.0969±0.0019,1mg/ml浓度的维生素C作用MKN45细胞24小时后, Caspase-3活性升高至0.3760±0.0230,对照组活性为0.0968±0.0012,1mg/ml浓度的维生素C组Caspase-3活性与对照组相比具有显著的统计学意义（P<0.05）。结论:1、1mg/ ml浓度的维生素C作用胃癌MKN45细胞24小时后,可诱导细胞凋亡,0.05mg/ ml至0.5mg/ ml浓度的维生素C对细胞有抑制作用,且0.05至0.5mg/ ml之间的浓度维生素C作用12,24,36小时后均对胃癌MKN45细胞有抑制作用。2、维生素C可能通过自氧化机制产生过氧化氢促进MKN45细胞凋亡,过氧化氢酶能翻转维生素C抑制MKN45细胞生长和促进其凋亡的作用。3、维生素C还可能通过调节BCL- 2基因家族表达和上调Caspase-3活性,启动线粒体细胞凋亡通路,引起肿瘤细胞生长抑制和凋亡。
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