杀蚜蝉拟青霉菌株筛选、培养及其致病作用研究

论文摘要

蝉拟青霉（Paecilomyces cicadidae（Miquel）Samson）是我国分布广泛,极具生防应用潜力的虫生真菌。本文以蚜虫为试虫,从不同来源的蝉拟青霉菌株中筛选出对中药材板蓝根蚜虫（Lipaphis erysimi）具有较高致病性的LB菌株,并系统研究其对蚜虫的入侵和致病过程、对蚜虫的致病性及其影响因子、生物学特性、液体及固体培养条件优化、粗毒素杀蚜活性及常用化学农药与该菌的相容性等内容。本研究旨在探索适合蝉拟青霉生物学特性的基本培养方法与技术,揭示其对蚜虫的致病机理及控制潜能,明确蝉拟青霉对蚜虫的相互作用关系,为蚜虫综合治理中有效利用蝉拟青霉提供理论依据,同时也为寄主与病原物互作关系的研究提供新的例证。结果如下:1、菌株筛选。以不同昆虫寄主采集的拟青霉（Paecilomyces）和白僵菌（Beauveria）菌株对白术蚜虫（Macrosiphum sp.）进行生物测定。结果表明,不同属种的真菌菌株的致病性存在差异,其中蝉拟青霉的几个菌株表现了较强的致病力。进一步对12株蝉拟青霉菌株培养特性及其对蚜虫的致病性进行测定,结果表明不同菌株的培养特性和致病力存在差异,其中以蝉拟青霉LB菌株的致病力强、培养特性优良,对蚜虫的校正死亡率为80.97%,致死中时LT50为4.44d,致死中浓度LC50为0.87×106孢子/mL。2、致病机理研究。通过扫描电镜观察,蝉拟青霉分生孢子在蚜虫体表萌发、形成芽管后可产生附着胞或直接侵入表皮,昆虫节间膜等薄弱处也是其侵染的主要部分,随后菌丝在昆虫体内形成,如湿度足够高,菌丝穿出体表产孢而再侵染新害虫。用明胶-琼脂平板法研究了蝉拟青霉12不同来源菌株的胞外蛋白酶产酶水平与其毒力的关系。结果表明,不同菌株的产酶水平存在差异,且产酶水平的高低与其对蚜虫的毒力存在显著性关系。因此可以认为该菌的胞外蛋白酶活力是构成毒力的主要因素之一。3、生物学特性及其与致病性的关系。温度、pH、湿度对蝉拟青霉生长、产孢及孢子萌发具有明显的影响。蝉拟青霉LB菌株生长、产孢及孢子萌发的最适温度是25℃。pH6时菌落生长最快,分生孢子产生及萌发的最适值为pH6～7。光照对菌落生长、孢子萌发没有明显影响,对产孢量有促进作用。孢子萌发的相对湿度范围为RH90%～100%,最适湿度是RH100%。在20～30℃范围内,蝉拟青霉LB菌株对蚜虫有致病性,在25℃下毒力最强;不同温度和不同pH值下培养的蝉拟青霉产孢量有差别,但所获得的分生孢子在相同条件下对蚜虫的毒力没有差异。在RH90～100%范围内,蝉拟青霉LB菌株对蚜虫有致病性,在RH100%时毒力最强。温度、湿度对致病性有重要的影响,在温度、湿度的互作中,湿度更具有重要作用。4、液体培养条件优化。通过对不同碳源、氮源、无机盐等对蝉拟青霉菌丝生长的影响研究,结果表明:葡糖糖为蝉拟青霉液体培养的最适碳源,蛋白胨为该菌生长的最适氮源,K2HPO4和MgSO4作为无机盐有利于菌丝生长。经正交试验筛选出的培养基为:葡萄糖3%,蛋白胨1.5%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.2%组合为优良的液体培养基。摇瓶发酵的适宜条件为:培养温度25～27℃,初始pH6～7,接种量6%,摇床转速为150r/min,500 mL三角瓶最适装液量为100 mL,发酵周期为7d。5、液体发酵代谢特性。随培养时间的延长,培养液中的还原糖含量、氨基氮含量、酸碱度和菌丝生物量均发生明显的变化。接种培养48h内,菌丝产量增长较慢;培养48～144h,菌丝生物量增长幅度最大,接种168h,菌丝生物量达22.45 g/L。培养液的pH值、糖含量、氮含量随培养时间的延长逐渐降低,菌丝快速生长的时期是糖、氮消耗最大的时期;192h后培养终止时,发酵液中的还原糖还有25%尚未消耗,而氨基氮的含量约为60%;接种72h后营养液的pH值降为4.56,因此接种72小时后,可适当增加pH值,以利蝉拟青霉菌丝生长。6、固体培养条件优化。经单因素、一般组合和正交试验筛选,得到其适宜的固态发酵培养基为玉米粉+麦麸+黄豆粉+米糠（6∶4∶1∶1）。培养条件筛选结果表明,该菌株固态发酵培养的优化条件为:接种量6%、料水比1∶1.2、初始pH值6～7、培养温度24℃、发酵时间22d、培养基厚度在2cm左右、光照24h/d,添加ZnSO4或BaCl2有利于产孢。在此优化条件下固态发酵培养,其孢子产量稳定在45×108个/g以上,最高产孢量达到54.72×108个/g。7、粗毒素杀蚜活性。发酵液对蚜虫的致死率达到81.11%,初步表明蝉拟青霉LB菌株液体培养能产生毒杀蚜虫的物质,而且杀虫活性较高。蚜虫对胞外粗毒素敏感,处理2d后的死亡率高,处理后蚜虫的死亡率随处理时间和浓度的提高而增加。胞内粗毒素提取物具有一定的杀蚜虫活性,但不及胞外粗毒素的效果明显。8、化学农药与蝉拟青霉的相容性及增效性。不同的化学农药对蝉拟青霉菌丝生长、分生孢子萌发均有不同程度抑制作用。杀菌剂对菌丝生长、产孢、孢子萌发抑制作用大,杀虫剂相对较小。结果表明吡虫啉对菌丝生长抑制作用小,对孢子萌发无明显的影响,因此可以作为蝉拟青霉混用的首选药剂。该药剂与菌混用后具有明显的增效作用,菌孢子液与药（1:15000或1:30000）混用,致死中时LT50提前,蚜虫的校正死亡率提高。

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Abstract

第一章前言

1.蚜虫的危害及防治

2 蚜虫病原真菌资源

3 杀蚜真菌的应用

4 蝉拟青霉的研究应用概况

4.1 蝉拟青霉的药理作用

4.2 蝉拟青霉对害虫的致病性及在生防中的应用

4.2.1 作为杀虫剂使用

4.2.2 具毒代谢产物及利用

第二章蝉拟青霉杀蚜优良菌株筛选

第一节不同属种昆虫病原真菌菌株筛选

1 材料和方法

2 结果与分析

2.1 不同属种的菌株对蚜虫的致病性

2.2 不同致病菌对蚜虫的致病力测定

2.3 优良菌株在不同温度下的致病力比较

2.4 优良菌株不同浓度孢子悬浮液处理蚜虫结果

3 讨论

第二节蝉拟青霉优良菌株筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 菌落形态及生长速率

2.2 产孢量及孢子发芽率

2.3 抗紫外线能力

2.4 孢子耐热性试验

2.5 孢子悬液杀蚜效果

2.6 发酵液杀蚜效果

3 讨论

第三章蝉拟青霉杀蚜机理研究

第一节蝉拟青霉对蚜虫侵染行为的初步研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 菌株的毒力

2.2 蝉拟青霉对蚜虫侵染的扫描电镜观察

3 讨论

第二节蝉拟青霉胞外蛋白酶与毒力的关系

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 胞外蛋白酶产酶量的测定

2.2 菌株毒力比较

2.3 胞外蛋白酶产量及其对蚜虫的毒力

3 讨论

第四章蝉拟青霉优良菌株生物学特性及其与毒力的关系

第一节蝉拟青霉生物学特性研究

1 材料和方法

2 结果和分析

2.1 不同碳源对蝉拟青霉菌丝生长和产孢的影响

2.2 不同氮源对蝉拟青霉菌丝生长和产孢的影响

2.3 温度对菌落生长、产孢和孢子萌发的影响

2.4 pH对菌落生长、产孢和孢子萌发的影响

2.5 光照对菌落生长、产孢和孢子萌发的影响

2.6 湿度对孢子萌发的影响

2.7 孢子致死温度测定

3 讨论

第二节蝉拟青霉致病性的影响因子

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 温度对蝉拟青霉毒力的影响

2.2 不同温度培养的蝉拟青霉对毒力的影响

2.3 不同湿度对蝉拟青霉毒力的影响

2.4 不同温湿度组合对蝉拟青霉毒力的影响

2.5 不同pH值培养的蝉拟青霉对毒力的影响

3 讨论

第五章蝉拟青霉营养需求及培养条件研究

第一节蝉拟青霉菌丝对不同碳、氮源及无机盐的利用研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 不同碳源对蝉拟青霉菌丝生长的影响

2.2 不同氮源对菌丝生长的影响

2.3 不同碳、氮比对菌丝生长的影响

2.4 不同无机盐对菌丝生长的影响

3 讨论

第二节蝉拟青霉液体培养基筛选及培养条件优化

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 培养基成分对菌丝生物量的影响

2.1.1 碳源的筛选

2.1.2 氮源的筛选

2.1.3 培养基成分综合试验

2.2 培养条件对菌丝生物量的影响

2.2.1 温度对菌丝生物量的影响

2.2.2 初始pH值对菌丝生物量的影响

2.2.3 瓶装量对菌丝生物量的影响

2.2.4 不同转速对蝉拟青霉菌丝生物量的影响

2.2.5 接种量对蝉拟青霉菌丝生物量的影响

2.2.6 培养时间对菌丝生物量的影响

3 讨论

第三节蝉拟青霉液体培养特性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 不同培养时间孢子萌发率

2.2 不同培养时间对菌丝生物量的影响

2.3 糖代谢特征

2.4 氨基氮代谢特征

2.5 发酵过程中pH值变化

3 讨论

第四节蝉拟青霉固态培养基筛选及培养条件研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 固态培养基筛选

2.1.1 单一基质对产孢量的影响

2.1.2 一般组合基质培养基对产孢量的影响

2.1.3 培养基正交筛选

2.2 固态培养参数对产孢的影响

2.2.1 液体种子接种量对固态发酵产孢的影响

2.2.2 初始含水量对产孢量的影响

2.2.3 初始pH值对产孢量的影响

2.2.4 培养温度对产孢量的影响

2.2.5 培养时间对产孢量的影响

2.2.6 培养基厚度对产孢的影响

2.2.7 光照对产孢量的影响

2.2.8 附加无机盐对产孢量的影响

3 讨论

第六章蝉拟青霉粗毒素杀蚜活性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 发酵原液及菌丝体水溶液杀蚜虫作用

2.2 代谢液粗毒素杀虫活性

2.3 菌丝体粗毒素提取物丙酮溶液杀蚜活性

3 讨论

第七章化学农药对蝉拟青霉的相容性及增效性研究

第一节不同化学农药对蝉拟青霉的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 不同药剂对蝉拟青霉菌落生长的影响

2.2 不同药剂对蝉拟青霉产孢量的影响

2.3 不同药剂对蝉拟青霉孢子萌发的影响

2.4 残效药剂对蝉拟青霉孢子萌发的影响

2.5 低剂量化学农药与菌混用的杀蚜虫效果

3 讨论

第二节吡虫啉对蝉拟青霉的影响及菌药混用研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 不同浓度吡虫啉对蝉拟青霉菌落生长的影响

2.2 不同浓度吡虫啉对蝉拟青霉产孢量的影响

2.3 不同浓度吡虫啉对蝉拟青霉孢子萌发的影响

2.4 不同浓度残效吡虫啉对蝉拟青霉孢子萌发的影响

2.5 生物测定

3 讨论

第八章结论与讨论

致谢

参考文献

附录

图版

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