论文摘要
目的:卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁妇女的健康。由于缺乏有效的早期诊断的方法,70%的卵巢癌患者被发现时已是晚期,卵巢癌也是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。其主要的死亡原因在于复发和包括顺铂在内的化疗药耐药,在现有的治疗手段下五年存活率未见明显增高,且长期化疗导致病人耐药或毒副作用的发生。因此,寻找新的更有效的药物以进一步提高卵巢癌患者的生存时间和生活质量是非常必要的。锑剂应用于人类,历史悠久,主要用于治疗寄生虫病。上世纪60年代初期进行筛选合成抗癌化合物时发现数种锑类化合物有抗癌活性。但一直未进行深入的研究。近年来关于锑类化合物的抗癌活性重新引起人们的重视。有关学者研究发现微摩尔浓度的锑剂（三氧化二锑）能显著抑制白血病细胞、恶性淋巴细胞生长,而对正常的淋巴细胞无影响,其机理为诱导细胞凋亡。于文强等通过研究不同锑剂对早幼粒细胞白血病凋亡诱导作用比较发现三价锑剂能够有效地诱导早幼粒白血病细胞凋亡,提示Sb2O3等三价锑剂在未来的抗癌作用方面有广阔的应用前景。本试验用三氧化二锑作用于体外培养的人卵巢癌细胞株SKOV3,观察其对卵巢癌细胞株增殖和凋亡的影响,初步探讨三氧化二锑的作用效果,为其用于卵巢癌的治疗提供实验及理论依据。方法:1三氧化二锑溶液的配制三氧化二锑溶于稀盐酸中制成1.1mmol/L的贮备液,4℃闭光保存。临用前搅拌至少30min,以含10%FBS RPMI1640培养基分别稀释至256.25μmol/L,保存三氧化二锑最多不超过3天。2细胞培养将处于对数生长期的卵巢癌细胞株SKOV3按照相应的浓度加入96孔板培养板于5%CO2、97%湿度、37℃的培养箱中培养24h后,设置空白对照组、高、中、低浓度组,每组加入等量培养液、不同浓度的三氧化二锑溶液。分别培养24、48、72h。3细胞形态学观察倒置显微镜、Giemsa染色和透射电镜观察细胞形态学变化。4 DNA Ladder测定提取细胞DNA,用1.5%琼脂糖凝胶电泳进一步检测肿瘤细胞发生的DNA降解。5流式细胞分析采用流式细胞仪定量分析经不同浓度三氧化二锑作用于卵巢癌细胞的凋亡率及其细胞周期特异性和蛋白bcl-2、bax的表达情况。结果:1采用MTT法检测细胞增殖抑制率,描绘生长柱状图可知经不同浓度三氧化二锑处理后的SKOV3细胞生长缓慢,明显的生长抑制,并呈作用浓度和时间依赖性。而空白对照组细胞则生长正常2细胞形态学观察倒置相差显微镜观察,对照组细胞生长良好,细胞透明,密度较大,呈复层性生长,细胞呈梭形,胞质内颗粒较少,细胞核隐约可见。实验组细胞密度明显减少,细胞颗粒较多,细胞间隙模糊,飘浮细胞数量增加,存活细胞显著减少。经Giemsa染色后进行光镜观察,可见到细胞形态也出现明显的改变。对照组细胞形态饱满,细胞核染色均匀,核仁清晰可见;实验组细胞中出现细胞质浓缩,变圆,核仁染色不均,核染色质边聚,但未见凋亡小体。提示实验组细胞出现凋亡的形态学改变。透射电镜观察到空白对照组和不同浓度三氧化二锑对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的超微结构形态学改变分别如下:空白对照组的正常肿瘤细胞形态:细胞形态呈多边形,核质比例失调,核大不规则,常染色质丰富异染色质少,核中央有一大而圆的核仁,细胞质内可见线粒体、粗面内质网,细胞表面的微绒毛减少;低浓度三氧化二锑实验组的凋亡肿瘤细胞形态为细胞形态更加不规则,细胞膜皱缩,线粒体嵴部分融合或消失,粗面内质网扩张,有颗粒融合或脱颗粒现象,核膜局部向外突起,核染色质浓缩,体积缩小,电子密度增加,边聚于核膜下,厚薄不均,有的形成半月;中浓度三氧化二锑实验组的凋亡肿瘤细胞形态除上述表现外,同时出现核浓缩,体积缩小,电子密度增高,部分核膜破碎形成核碎片;高浓度三氧化二锑实验组的凋亡肿瘤细胞形态为部分核膜外层溶解、消失,线粒体嵴大部分融合消失,粗面内质网脱颗粒现象严重,核碎裂呈两大片,但未见典型的凋亡小体。提示三氧化二锑对人卵巢癌SKOV3细胞有一定的诱导凋亡作用,且随着药物浓度的增大,细胞凋亡的形态学改变越明显。3细胞增殖抑制实验采用MTT法检测细胞增殖抑制情况。4 DNA Ladder测定提取对照组和实验组细胞DNA,经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示实验组细胞DNA出现凋亡的特征性改变,即DNA呈梯度样降解并随作用浓度的增大,梯度样条带逐渐明显。而对照组细胞未出现凋亡的特征性改变。5细胞凋亡率变化流式细胞仪检测表明与对照组相比,不同浓度三氧化二锑实验组细胞凋亡率升高明显（P<0.01）,细胞周期的改变实验组细胞与对照组细胞相比随着药物浓度的增加,G0/G1期和S期细胞逐渐减少（P<0.01）,而G2/M期细胞逐渐增加（P<0.01）。6 bcl-2与bax蛋白表达量经不同浓度的三氧化二锑作用48h后,bcl-2蛋白表达量减少,bax蛋白表达量增加（P<0.01）。结论:1三氧化二锑能抑制体外培养的人卵巢癌SKOV3细胞的生长,并呈时间和剂量依赖性。2三氧化二锑能诱导SKOV3细胞凋亡,诱导凋亡可能为其抑制细胞生长的机制之一。3细胞凋亡可能与下调bcl-2蛋白的表达,上调bax蛋白表达有关,这可能是其诱导SKOV3细胞凋亡的途径之一。4本研究为今后的实验和临床研究提供了初步的理论依据,同时表明三氧化二锑在治疗卵巢癌方面有一定的应用前景。