论文摘要
目的评价不同剂量125I籽粒近距离照射对神经胶质瘤干细胞的杀伤作用，探讨125I籽粒杀伤胶质瘤干细胞的作用机理与放射剂量，同时与神经干细胞进行放射对照，了解神经胶质瘤干细胞与神经干细胞对125I籽粒近距离照射的敏感性差异。旨在为125近距离照射在临床治疗胶质瘤的进一步应用提供一定的实验依据，同时也为胶质瘤的发生机理提供了实验理论基础，并且为神经胶质瘤干细胞与神经干细胞的鉴别提供了一定的实验依据。方法术中取髓母细胞瘤细胞，接种于含生长因子的无血清培养基中行原代培养，使其中的脑肿瘤干细胞增殖，形成悬浮生长的细胞球。将细胞球吹打成单细胞后，取其中部分细胞，利用细胞免疫荧光检测脑肿瘤干细胞在细胞培养CD133的表达，并计算CD133阳性细胞的比例。另一部分细胞继续培养，3-5天后有大量细胞球生成，取细胞对数生长期离心（酶消化法：胰蛋白酶0.25％和EDTA 0.02％），吹打成单细胞悬液。并将125I籽粒置入，培养皿中共同培养。细胞悬液密度为13×104，按照射吸收剂量分4组，每组为—96孔板培养。每组按照射剂量（空白对照、10Gy、20Gy、30Gy）设四个时间段0、20、40、60个小时，每个时间段设四孔，每孔液体量200μl，细胞数为2.6×104，其中三孔记细胞死亡数取平均值，另一孔做生长抑制实验用。同时取神经干细胞（由昆明医学院神经科学研究所提供）按神经干细胞培养方式传代培养3-5天后，形成细胞球，吹打成单细胞悬液，取相同剂量设定为对照组，与脑肿瘤干细胞进行照射比较。对脑肿瘤干细胞给予不同剂量、不同时间的近距离照射，检测CD133阳性细胞死亡率，增殖抑制的改变；通过细胞克隆形成法，测定125I籽粒近距离照射对脑肿瘤干细胞的生长抑制作用，同时与神经干细胞进行照射对照，检测两组细胞对125I籽粒射线的敏感性差异。结果与对照组比较，照射组细胞死亡率，增殖抑制率明显升高。脑肿瘤干细胞（CD133阳性）在不同的照射时间段内（即0、20、40、60小时）的细胞比例分别为0.25、0.14、0.10、0.04。实验组与对照组比较，P＜0.05．有显著性意义；实验组内20小时与40小时比较，无显著性差异；20小时与60小时比较，P＜0.05。有显著性意义。125I籽粒各实验组生长曲线抑制克隆形成，较空白组明显降低。不同照射时间段内的生长分数分别为1、0.75、0.52、0.25。125I籽粒对脑肿瘤干细胞的存活曲线为一条直线，直线回归方程为Y=40.979-38.205X，方程配合度检示：F=51.713，P＜0.001，表明细胞存活率和125I籽粒放射活度线性有回归关系，且两者相关性检验呈直线负相关（r=-0.981，P＜0.05）；与神经干细胞比较，脑肿瘤干细胞对于125I籽粒的敏感性具有显著性差异。结论1．本实验结果初步证明了人脑髓母细胞瘤中可以原代培养出脑肿瘤干细胞，这点与肿瘤干细胞理论相符合。2．通过免疫荧光染色的方法证明了神经干细胞的特异性标记物CD133也同样可以标记脑肿瘤干细胞。3．利用放射性物质125I籽粒近距离照射脑肿瘤干细胞，结果表明，不同剂量、不同照射时间细胞的死亡比例不同，随着照射剂量的增加，细胞死亡比例增加，同时脑肿瘤干细胞的生长抑制也随着放射剂量的增加而增加。这点也与实验预期的设想相吻合。4．本实验对脑肿瘤干细胞与神经干细胞分别进行了近距离照射，结果表明，相同的放射剂量，脑肿瘤干细胞对125I籽粒的射线更敏感，两者的细胞死亡数具有显著性差异。这也说明神经干细胞与肿瘤干细胞在细胞特性上存在一定的差异。但是，对于两者对于射线敏感性的差异的机制，还有待于进一步研究。5．本实验为体外照射实验，结果表明，125I照射剂量达到30Gy时，对脑肿瘤干细胞的杀伤作用最明显，与其他剂量组有统计学意义。但是，体内与体外的影响因素很多，所以对于125I籽粒的临床照射剂量的研究还有很多工作要做。综上，体外125I籽粒近距离照射可以通过导致细胞死亡、抑制脑肿瘤干细胞增殖，在胶质瘤的治疗中发挥作用，具有进一步临床应用的前景。