芽孢杆菌A-47鞭毛蛋白基因的克隆及其与定殖相关性初探

论文摘要

植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内,并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物。诸多研究结果表明,部分植物内生细菌对植物是有益的,因此,这部分植物内生细菌的研究已成为国内外研究的热点之一。 蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）A-47是本实验室从小麦根部分离的一株内生增产细菌。它可以在小麦的根部定殖,但其定殖机理目前尚不清楚,本研究从该菌的鞭毛蛋白基因入手,先克隆基因,然后采用插入突变方法获得突变菌株,再比较突变株与野生菌株之间的性状差异,为明确细菌的定殖因子做一些初步探索。 由鞭毛蛋白基因的同源序列设计引物,以蜡样芽孢杆菌A-47的基因组DNA为摸板,扩增获得了两个鞭毛蛋白基因,分别命名为flaA和flaB;选取flaA基因中780bp的片段,连接到自杀载体pHSG299上,电击转化A-47,利用同源重组原理,获得了一个鞭毛蛋白基因插入突变体,电镜观察发现突变体不能再产生鞭毛;用突变体和双抗标记的A-47（野生型）以浸种法分别接种小麦,14天后取6株小麦的根部,分别测定野生型菌株和突变体在小麦根部表面的定殖量,测定结果分别为8.2和7.4(Log10 of cfu/g根鲜重);同时取12株小麦分别测定野生型菌株和突变体在小麦根内的定殖量,测定结果分别是6.1和5.0(Log10 of cfu/g根鲜重);研究结果还突变体在根内部的定殖量可能随根部表面定殖量的下降而减少,但本试验还只是得到了一些初步结果,至于鞭毛是否在内生定殖阶段发挥多大作用尚不明确,要彻底解析鞭毛与定殖的关系,还需要大量的后续工作。

论文目录

• 第一章 引言
• 1.1 本研究的实用价值和理论意义
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 微生态学的提出和发展
• 1.2.2 植物微生态学的建立和发展
• 1.2.3 植物内生细菌研究进展
• 1.2.4 鞭毛参与部分内生细菌与宿主的互作
• 1.3 本研究要解决的问题
• 第二章 蜡样芽孢杆菌A-47鞭毛蛋白基因的克隆
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 化学试剂与试剂盒
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 缓冲液及药剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 蜡样芽孢杆菌A-47的培养
• 2.2.2 蜡样芽孢杆菌A-47基因组DNA的提取（使用1.5ml离心管）
• 2.2.3 蜡样芽孢杆菌A-47鞭毛蛋白基因的扩增
• 2.3 结果
• 2.3.1 部分序列的扩增
• 2.3.2 全序列的获得
• 第三章 A-47鞭毛蛋白基因突变体菌株的获得
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 培养基与培养条件
• 3.1.3 化学试剂与试剂盒
• 3.1.4 仪器
• 3.1.5 缓冲液及药剂配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 突变所用片段的扩增
• 3.2.2 PCR产物的回收
• 3.2.3 回收DNA片段与载体的连接
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.5 热击转化大肠杆菌感受态细胞
• 3.2.6 质粒DNA的提取
• 3.2.7 质粒的酶切鉴定
• 3.2.8 芽孢杆菌电击转化感受态细胞的制备
• 3.2.9 芽孢杆菌感受态细胞的电击转化
• 3.2.10 突变体的鉴定
• 3.3 结果与分析
• 第四章 突变体与野生菌株定殖能力的比较
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 植物
• 1.1.3 双抗标记的诱导
• 1.1.4 种子表面消毒和接种
• 1.1.5 测定细菌在小麦根部表面的定殖量
• 1.1.6 测定细菌在小麦根内部的定殖量
• 1.2 结果与分析
• 第五章 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介