鞘氨醇单胞菌JS061咔唑降解基因簇上游基因的分离和鉴定

论文摘要

咔唑是典型的含氮杂环芳烃污染物,具有致毒、致癌和致突变的“三致”作用,会给环境和人类带来巨大的危害。微生物在环境治理方面具有高效、专一、经济和节能等诸多优点,所以本实验利用微生物作为实验材料研究了咔唑降解的机制。本研究选择了从咔唑污染土样中分离得到的一株能够降解咔唑的革兰氏阴性菌鞘氨醇单胞菌JS061作材料来研究咔唑降解过程中各基因的特点及其编码的酶蛋白的性质。从鞘氨醇单胞菌JS061菌株的基因组DNA中分离得到降解咔唑的上游基因的基因簇,利用软件和BLAST分析之后,证实我们获得了完整的降解咔唑的上游基因。将该序列提交GenBank,获得了该基因的序列号为EU854302。从BLAST比对结果和结果中发现该基因簇是由基因carAaBCAc构成,并且明确了该菌株中这几个基因的排列顺序为carAa→carB→carC→carAc。通过Southern杂交验证了该基因簇是来自于鞘氨醇单胞菌JS061基因组,并且以单拷贝的形式存在。利用pET28a（+）质粒分别构建了carAa,carAc,carB和carC基因的原核表达载体,实现了这四种蛋白在BL21（DE3.0）中的表达。确定了这四种蛋白的分子量分别为43 kDa, 15 kDa, 29 kDa（CarBa）/10 kDa（CarBb）和31 kDa。但构成carB的两个组分CarBa和CarBb的表达比例上与其他菌种表达的CarB蛋白有很大差别。同时本研究利用底物显色反应验证了pETWB重组质粒中表达的CarB蛋白具有裂解2,3-二羟基联苯的生物学活性。本实验利用Ni-NTA agarose成功的纯化了含有六个组氨酸的CarB和CarC融合蛋白,并利用BALB/c雌性小鼠制备了CarC蛋白的多克隆抗体。利用该抗体在蛋白水平检测了Sphingomonas sp.JS061中carC蛋白在不同底物浓度时的表达情况以及在相同浓度下不同诱导时间的蛋白表达情况。结果证实了该蛋白只有在有底物存在时才表达,而且在诱导时间相同、底物浓度不同时蛋白表达有明显的差别,证明了降解咔唑的酶蛋白属于诱导表达类蛋白。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 1.1 咔唑的性质
• 1.2 咔唑降解菌株
• 1.3 咔唑的降解途径
• 1.4 降解咔唑的酶及其性质的研究进展
• 1.4.1 1，9a-双加氧酶（CARDO）
• 1.4.2 2’-氨基联苯-2，3-二羟基1，2-双加氧酶（HOADA）
• 1.4.3 间位裂解化合物水解酶
• 1.5 咔唑降解基因簇的定位和分布的研究
• 材料和方法
• 2.1 实验仪器
• 2.2 实验试剂和酶制剂
• 2.3 carAa,carAc,carB,carC 及car 基因簇重组质粒构建
• 2.3.1 菌株、引物信息既反应体系
• 2.3.2 细菌基因组DNA 的提取
• 2.3.3 基因片段的回收
• 2.3.4 DNA 回收片段与pET-28a（+）载体的连接
• 2.3.5 BL21 超级感受态的制备
• 2.3.6 连接体系的转化
• 2.3.7 质粒提取
• 2.3.8 重组质粒的PCR 鉴定
• 2.3.9 重组质粒的酶切鉴定
• 2.4 基因在PJ061 基因组DNA 上的定位
• 2.4.1 EcoRI 和BamHI 酶切基因组DNA
• 2.5 BL（pETWB）中表达的酶的生物活性检测
• 2.6 目的蛋白的表达和纯化
• 2.6.1 CarAa,CarAc,CarB,CarC 蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.6.2 CarB 和CarC 蛋白的纯化
• 2.7 CarC 融合蛋白抗体的制备及抗体效价的检测
• 2.7.1 动物材料
• 2.7.2 CarC 融合蛋白免疫BALB/c 小鼠
• 2.7.3 小鼠CarC 多抗的收集和保存
• 2.7.4 CarC 融合蛋白抗体的ELISA 检测
• 2.8 CarC 蛋白的Western-blot 检测
• 2.8.1 菌体的处理和SDS-PAGE 凝胶电泳
• 2.8.2 蛋白的转膜和杂交
• 结果
• 3.1 细菌的筛选和鉴定
• 3.2 降解咔唑的上游基因的克隆和鉴定
• 3.2.1 car 基因簇的克隆及鉴定
• 3.2.2 car 基因簇在JS061 基因组上的定位
• 3.3 car 基因簇中各基因表达载体的构建与表达
• 3.3.1 carAa 基因表达载体的构建、鉴定和表达
• 3.3.2 carAc 基因表达载体的构建和鉴定
• 3.3.3 carB 基因表达载体的构建和鉴定
• 3.3.4 CarB 蛋白的表达和纯化
• 3.3.5 CarC 蛋白的表达载体的构建和鉴定
• 3.3.6 CarC 蛋白的表达和纯化
• 3.4 CarC 多克隆抗体的制备及效价检测
• 3.5 CarB 蛋白生物活性的检测
• 3.6 咔唑诱导下JS061 中CarC 蛋白表达水平的检测
• 讨论
• 4.1 car 基因簇的分离和carC 基因的定位
• 4.2 carAa，carAc，carB 和carC 基因的表达
• 4.3 JS061 中CarC 蛋白的诱导表达
• 结论
• 参考文献
• 致谢