论文摘要
研究背景目前全世界约2亿人患有骨质疏松症（osteoporosis,OP）,其发病率已跃居常见病、多发病的第七位,特别需要强调的是,目前医学上还未有安全而有效的根治方法。越来越多的研究发现,骨髓内脂肪组织增多与骨质疏松存在密切联系。一旦骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）过多地向成脂细胞方向分化,相应地,向成骨细胞分化的细胞数就会减少,进而引起成骨缺陷的骨质疏松。褪黑素（melatonin,MT）是松果体（pineal gland,PG）和骨髓在生理条件下,合成和分泌的一种激素,MT直接或间接参与了体内所有的体液调节,随着人的衰老,MT的分泌量随之降低。根据最新的研究显示: MT可以促进骨折愈合和抑制脂肪酸聚集作用。这些新发现的MT的作用,再加上MT分泌的年龄依赖性,让我们对OP的研究有了新的思路和方向。目的通过体外分离和培养大鼠BMSCs,研究MT对大鼠BMSCs成脂分化的影响以及MT作用的机制,进一步探讨OP的发病机制。方法1.大鼠BMSCs原代培养与鉴定6月龄SD大鼠,无菌条件下取出骨髓,采用Percoll淋巴细胞分离液梯度离心法进行分离,获得原代hMSCs后,接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。待细胞生长至90%融合时,用0.25g/L浓度胰蛋白酶消化传代。在倒置显微镜下观察BMSCs的形态,流式细胞仪检测第3代大鼠BMSCs CD29、CD34及CD44的表达。2.大鼠BMSCs脂化诱导培养及分组干预取大鼠骨髓分离培养MSCs,经传代脂向分化,分组进行干预。对照组为单纯脂向分化（模型）组;实验A组用MT进行干预;实验B组用MT和其受体拮抗剂2-苯基-N-乙酰色胺（luzindole,LZD）共同干预。检测脂肪细胞的比例来比较各组的脂化程度,并应用Rt - PCR技术检测各组细胞中成脂转录因子过氧化物酶体增殖体激活受体γ（PPARγ）mRNA的表达。结果1.密度梯度离心法和贴壁分离培养,本实验在体外培养获得了BMSCs细胞。2.加入MT干预的实验A组,与单纯脂化诱导的对照组比较,可使BMSCs脂化明显受抑（p<0.01）。加入LZD和MT干预的实验B组,与单纯脂化诱导的对照组比较,两组细胞的脂化程度无明显差别（p>0.05）;而与只加入MT干预的实验A组比较,实验B组的脂化程度明显提高（p<0.01）。结论1.采用密度梯度离心法和贴壁分离培养,能在体外获得BMSCs细胞。进一步验证骨髓间充质干细胞可以向脂肪细胞方向分化,说明骨髓间充质干细胞具有向本胚层纵向分化的潜能。2. MT能抑制BMSCs向成脂方向分化,能降低细胞中的PPARγmRNA表达水平,这一作用是通过其受体机制起作用。这可能与骨质疏松OP的病因学有关。
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