论文题目: 鸡X期胚盘细胞体外培养与输卵管生物反应器的研制
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 张传生
导师: 杜立新
关键词: 期胚盘细胞,基因,绿色荧光蛋白基因,盒式交换
文献来源: 山东农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 鸡输卵管生物反应器研制已成为转基因研究热点之一。人们尝试应用多种方法研制鸡输卵管生物反应器,但至今没有取得令人满意的效果。因此探索更为有效的转基因鸡制备途径已成为目前研究的一个重要课题。应用鸡内源性的调控元件指导外源基因在鸡输卵管特定的表达是研制鸡输卵管生物反应器的一种全新策略,需要对家禽多能细胞体外长期培养和遗传修饰。因此本研究首先对胚盘细胞的进行体外培养、标记,探索对鸡早期胚盘细胞遗传修饰技术,继而构建可用于输卵管生物反应器研制的表达载体,取得如下结果: 1.克隆寿光鸡cENS2基因的U3R调控区,序列分析表明该调控区含有CES细胞特异的增强子B区;U3R调控区与pEGFP-N载体融合构建了鸡CES细胞特异表达载体pEGFP-cENS2-Promoter,通过转染胚盘细胞、CEF细胞验证其特异的启动子活性。 2.应用pEGFP-cENS2-Promoter转染不同区域的胚盘细胞从而从分子水平确定CES细胞或其前体细胞主要分布在胚盘明区。 3.以pEGFP-N作为阳性对照,应用pEGFP-cENS2-Promoter载体转染胚盘单层细胞并进行G418药物筛选,表明体外培养一周胚盘细胞依然具有部分细胞的干细胞特性,但难以获得增殖性能强的稳定整合的细胞克隆。 4.以BRL-3A细胞条件的基础培养基添加2%鸡血清,0.1mMβ-巯基乙醇,2mML-谷氨酰胺,10mM HEPES(PH7.6),100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,10ng/ml庆大霉素,20ng/ml伴白蛋白,胎牛血清及细胞因子为配制CES完全培养基,结合应用小鼠成纤维细胞饲养层,分离获得短期传代(3代)的具有胚胎干细胞表型(PAS、AKP染色阳性)的细胞克隆。 5.应用pEGFP-cENS2-Promoter载体对分散成单个X期胚盘细胞进行瞬时转染,应用CES完全培养基联合SNL饲养层对转染后的细胞继续培养、并进行G418筛选,可以延长标记细胞的体外培养时间,为对细胞遗传修饰奠定了技术条件。 6.以pLNHX载体为骨架,切去HSP70启动子同时插入OV-INF-IRES2-EGFP-PolyA表达盒,构建了两个(正反向)卵清蛋白基因启动子指导的猪β干扰素和绿色荧光基因共表达的逆转录病毒表达载体命名为pLNHX-OV-INF-IRES2-EGFP(±),测序验证表明各组件连接正确。 7.通过电泳阻滞实验确定DNA与PEI的N/P=3,配制pLNHX-OV-INF-IRES2-EGFP(+)/PEI溶液经翅静脉体内转染产蛋鸡,通过RT-PCR证明目的基因在输卵管
论文目录:
符号说明
中文摘要
英文摘要
第一章 文献综述
第一节 转基因鸡的研究概况
1. 鸡独特的生理生殖特点
2. 转基因技术的研究现状
3. 问题与展望
第二节 鸡胚胎干细胞体外培养及转基因策略
1.鸡胚胎干细胞体外培养研究历程
2.鸡胚胎干细胞体外培养条件探讨
3.鸡胚胎干细胞生物学特性及鉴定方法
4.鸡胚胎干细胞转基因策略
5.问题与展望
第三节 家禽输卵管生物反应器制备中表达载体的发展
1.普通质粒的表达载体
2.人工染色体的表达载体
3.基因打靶载体
4.展望
第四节 重组酶介导的盒式交换技术的研究进展
1.重组酶及其介导的位点特异性重组
2.RMCE的特点
3.RMCE的应用策略
4.RMCE的应用前景
第二章 本研究的目的意义
第三章 材料与方法
3.1 载体及其来源
3.2 菌株及其基因型
3.3 实验动物及其来源
3.4 细胞系
3.5 分子生物学试剂
3.6 细胞生物学试剂
3.7 常用溶液配方
3.8 主要仪器
3.9 主要分子生物学数据库及其软件
3.10 分子生物学基本技术
3.11 细胞生物学基本技术
第四章 鸡X期胚盘细胞体外培养方法的建立
第五章 鸡胚胎干细胞特异表达载体的构建与表达
第六章 猪β-INF的逆转录病毒表达载体的构建及鸡输卵管的定位表达
第七章 基于Cre“交换盒”的鸡OV位点双交换打靶载体系统的构建与验证
第八章 总结论
参考文献
附录
1.附录1 彩图及其说明
2.附录2 受赠材料
3.附录3 pSSC-9载体序列信息
4.附录4 鸡卵清蛋白基因序列
5.附录5 pIRES-EGFP载体信息
致谢
攻读学位期间发表论文情况
发布时间: 2005-10-11
参考文献
- [1].表达人组织激肽释放酶鸡输卵管暂态生物反应器的研究[D]. 高波.扬州大学2005
- [2].柯萨奇病毒B4单、双siRNA表达载体的构建及其抗病毒作用研究[D]. 史红艳.吉林大学2006
- [3].HBsAg真核表达载体的构建及在CHO细胞高效表达的研究[D]. 张艳.吉林大学2008
- [4].杨树木质素合成酶PAL基因的克隆、鉴定及其表达载体的构建[D]. 薛永常.中国林业科学研究院2001
- [5].猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆及其复制子载体的研究[D]. 黄勤锋.华中农业大学2009
- [6].大青杨纤维素合酶基因的克隆与遗传转化的研究[D]. 许雷.东北林业大学2011
- [7].Rhodobacter sphaeroides puc2BA的功能及Rhodovulum sulfidophilum pucsBA在Rhodobacter sphaeroides中的异源表达研究[D]. 王万能.重庆大学2008
- [8].不同茎部长度shRNA对模型小鼠EGFP基因表达干扰的研究[D]. 刘中华.西北农林科技大学2011
- [9].光诱导表达载体的构建及其在盐藻除草剂抗性转化中的应用[D]. 张贵星.郑州大学2003
- [10].芋螺毒素基因重组表达研究[D]. 高炳淼.海南大学2012
相关论文
- [1].精原干细胞途径建立hFIX转基因小鼠及Flt3配基乳腺生物反应器研究[D]. 王宁.复旦大学2003
- [2].采用转染血液循环期原始生殖细胞方法和鸡—兔异种动物核移植方法制备转基因鸡[D]. 周振明.中国农业大学2004
- [3].人胎盘碱性磷酸酯酶（PLAP）在母鸡输卵管中表达及其相关研究[D]. 刘影.华东师范大学2004
- [4].小尾寒羊多胎性状相关基因的鉴定和遗传研究[D]. 柳淑芳.山东农业大学2004
- [5].鸡输卵管组织特异性基因打靶载体的构建及诱导鸡免疫耐受模型的建立[D]. 赵晨.中国农业大学2005
- [6].表达人组织激肽释放酶鸡输卵管暂态生物反应器的研究[D]. 高波.扬州大学2005
- [7].精子介导的人凝血因子Ⅸ转基因绵羊技术研究[D]. 李峰.复旦大学2005
- [8].生产转基因鸡基础理论和方法的研究[D]. 李碧春.西北农林科技大学2000
- [9].鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究[D]. 秦洁.扬州大学2006
- [10].慢病毒载体法高效转基因鸡制备技术研究[D]. 徐世永.南京农业大学2007
标签：期胚盘细胞论文; 基因论文; 绿色荧光蛋白基因论文; 盒式交换论文;