免疫刺激后中国明对虾血液抗菌力应答及两种免疫相关因子LYZ和AK的研究

论文题目: 免疫刺激后中国明对虾血液抗菌力应答及两种免疫相关因子LYZ和AK的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 海洋生物学

作者: 姚翠鸾

导师: 相建海

关键词: 中国明对虾,海带多糖,溶酶体,溶菌酶,精氨酸激酶

文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 本文采用细胞学，生物化学，分子生物学和蛋白质组学等技术，对对虾的抗菌能力和免疫防御机制进行研究，筛选了灵敏稳定的抑菌和溶菌检测方法；并对灭活鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和海带多糖(laminarin，一种B-1, 3 葡聚糖)免疫诱导后的中国明对虾( Fenneropenaeus chinensis )血细胞数目，血淋巴的抑菌活力，溶菌能力，溶酶体膜的稳定性进行分析；对两种重要免疫因子溶菌酶(LYZ)和精氨酸激酶(AK)进行克隆和表达分析。得到以下结果：中国明对虾受到免疫诱导后血细胞数量表现出明显变化。 1 10-7 灭活鳗弧菌攻毒后血细胞数量明显降低, 最低值出现在攻毒后45min 总血细胞数量(THC)下降了73%(p<0.05)，随后逐渐回升，至48h恢复注射前水平。注射海带多糖试验组的对虾血细胞数量明显高于对照组，最高值出现在注射后3h(p<0.05)， THC比对照组高出一倍，注射后12h，接近对照组水平。注射生理盐水引起了THC的少量增加，但很快恢复到注射前水平。采用中性红保留时间分析体外不同剂量海带多糖对溶酶体膜稳定性的影响结果显示，在海带多糖浓度为 1 10-5mg/ml 至 0.1mg/ml 之间时中性红保留时间均有所增加，最长的中性红保留时间为 205min ，对应的海带多糖浓度为 1 10-3mg/ml，但是当海带多糖浓度为 1mg/ml 时，溶酶体膜中性红保留时间缩短。体内注射海带多糖明显增加了溶酶体膜的稳定性，中性红保留时间在每尾虾注射0.1mg 海带多糖后明显延长，最长的保留时间出现在注射海带多糖后 3h，保留时间为 180min(p<0.05) 然后逐渐下降， 48h 时恢复对照组水平。对照组的中性红保留时间为８１ｍｉｎ，与非注射组相比没有明显差别。与鳗弧菌体外混合和体内注射均引起了血细胞溶酶体膜稳定性的显著降低。通过对抑菌检测方法进行筛选，结果表明液体培养基微量稀释评估法抑菌效果灵敏度最高，抑菌圈法灵敏度最低，但对于对虾的血浆，辐射扩散法被证明在抑菌活性检测方面更为适用。利用改进的辐射扩散法对灭活鳗弧菌攻毒前后的中国明对虾血细胞和血浆的抑菌活性进行了检测，结果显示，虽然攻毒后血细胞数目显著降低(p<0.05)，但其抑菌能力却明显增强(p<0.05)，相对而言，血浆抑菌活性变化不显著(p>0.05)，说明血细胞在受到免疫刺激后抗菌因子的表达进一步加强。 III<WP=5>姚翠鸾免疫刺激后中国明对虾血液抗菌力变化及两种免疫相关因子 LYZ 和 AK 的研究博士学位论文在未经免疫诱导的中国明对虾的血浆中，未检测到溶菌酶活性，仅在血细胞中检测到溶菌酶活性。血细胞溶菌酶活性在用灭活鳗弧菌和海带多糖进行免疫诱导后均表现出上升趋势。灭活的鳗弧菌引起血浆溶菌酶活性增加，但海带多糖诱导后没有检测到溶菌酶活性。对虾生理盐水诱导引起血细胞溶菌酶活性的少量增加，但未检测到血浆溶菌酶活性。采用 Rotofor? cell 对溶菌酶活性较高的血淋巴样品进行分离，发现它含有 pI9.2 和 pI10.0 的两种不同等电点的溶菌酶，其中 pI为 10.0 的组分具有几丁酶活性。实验采用同源克隆和ＲＡＣＥ　ＰＣＲ的方法，在中国明对虾血液ｃＤＮＡ中获得了全长为８１７ｂｐ中国明对虾ｃ型溶菌酶　ｃＤＮＡ序列。该序列包含中国明对虾ｃ型溶菌酶的成熟肽区域，１１７ｂｐ的５端非翻译区，４６８ｂｐ的开放读码框和２２６ｂｐ的３端非翻译区。３端非常保守，加尾信号（ＡＡＴＡＡＡ）位于终止密码子ＴＡＧ下游１９４ｂｐ处。推测的溶菌酶成熟肽蛋白质序列由１３８个氨基酸组成，理论分子量为１５９９７．９５理论等电点为９．７９。应用大肠杆菌对体外重组的溶菌酶基因成功地进行了表达。溶菌酶重组蛋白在胞浆中形成了不溶的包涵体，采用提取缓冲液变性后，以Ｃｏ－亲和层析柱对它进行纯化。在变性条件下，获得了纯度较高的中国明对虾ｃ型溶菌酶重组蛋白，经复性后表现出溶菌酶活性。　本实验还首次利用蛋白质组学技术对2D凝胶上的精氨酸激酶成功进行了鉴定，并发现在海带多糖注射后 45min的血浆中精氨酸激酶是变化最明显的蛋白之一。克隆得到了１１８４ｂｐ编码中国明对虾精氨酸激酶的ｃＤＮＡ片段，包含一个1068bp的开放阅读框，根据其推断的蛋白质包含 356 个氨基酸残基，理论分子量为40129.73Da，等电点为 5.92，进化十分保守。海带多糖免疫刺激后 3h，精氨酸激酶的表达量明显回升。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章文献综述

1.1 前言

1.2 对虾免疫机制概述

1.3 对虾免疫相关因子的克隆和表达研究进展

1.4 蛋白质组学在对虾免疫研究中的应用及前景展望

1.5 本研究的目的意义

第二章免疫刺激后中国明对虾血细胞溶酶体膜的稳定性分析

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章免疫刺激后中国明对虾血液抗菌能力溶菌酶活力分析

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章中国明对虾Ｃ型溶菌酶的克隆表达和体外重组蛋白的纯化

4.1 中国明对虾ｃ型溶菌酶的克隆和组织表达

4.1.1 材料与方法

4.1.2 结果

4.1.3 讨论

4.2 中国明对虾ｃ型溶菌酶的体外重组及在大肠杆菌中的表达

4.2.1 材料与方法

4.2.2 结果

4.2.3 讨论

第五章免疫刺激后中国明对虾血浆蛋白质变化及精氨酸激酶的克隆

5.1 海带多糖刺激后血浆蛋白质表达差异

5.1.1 材料与方法

5.1.2 结果

5.1.3 讨论

5.2 中国明对虾精氨酸激酶的克隆及在海带多糖刺激后的变化

5.2.1 材料与方法

5.2.2 结果

5.2.3 讨论

主要结果与结论

参考文献

发表和已完成的文章列表

致谢

发布时间: 2005-04-18

参考文献

[1].中国明对虾重要分子伴侣蛋白基因的克隆及表达研究[D]. 栾伟.中国科学院研究生院（海洋研究所）2009
[2].光照对中国明对虾（Fenneropenaeus Chinensis）生长的影响及其机制[D]. 王芳.中国海洋大学2004
[3].中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）抗菌因子及模式识别蛋白的研究[D]. 柳峰松.中国科学院研究生院（海洋研究所）2005
[4].中国明对虾免疫等相关基因的克隆、重组表达与功能分析[D]. 张继泉.中国科学院研究生院（海洋研究所）2005
[5].中国明对虾体内凝结反应过程中相关免疫基因的克隆与表达研究[D]. 刘逸尘.中国科学院研究生院（海洋研究所）2005
[6].对虾行为生理生态学的实验研究[D]. 张沛东.中国海洋大学2006
[7].中国明对虾先天免疫的模式识别与效应分子[D]. 杜欣军.山东大学2007
[8].中国明对虾免疫系统中抗氧化相关基因的克隆与表达分析[D]. 张庆利.中国科学院研究生院（海洋研究所）2007
[9].中国明对虾病原检测新方法及酚氧化酶通路相关基因的研究[D]. 高宏伟.中国科学院研究生院（海洋研究所）2008
[10].中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）卵黄蛋白的生化性质及基因克隆[D]. 谢松.河北大学2006

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