石刁柏雌雄株间细胞学、内源物质及分子标记研究

论文摘要

石刁柏是世界上广泛栽培的重要的经济作物之一,其雄株比雌株高产且有较强的抗病性和生命力,故雄株特别是超雄株倍受生产者的青睐,但由于直到在开花时期,雌雄株在形态上仍难以区分,因此利用传统的方法培育纯雄株栽培群体费时费力。同时,石刁柏也是研究植物性别决定机制的模式材料之一,但是由于石刁柏基因组信息缺乏,没有建立高密度图谱,限制了石刁柏分子标记辅助育种的应用和基于遗传图谱的性别决定基因的克隆和性别决定机制的理解。本研究首先从细胞学确定石刁柏的性别决定方式,在此基础上分析雌雄性别间的生理代谢差异;利用RAPD、AFLP分子标记技术分析其基因组差异信息,开发性别鉴定的分子标记,为石刁柏的高效栽培生产服务;同时为石刁柏的性别决定理论机制的研究提供重要的依据。主要研究结果如下:1、石刁柏性染色体的细胞学分析。利用常规细胞学技术对石刁柏核型、花粉母细胞减数分裂、G-带及DAPI荧光带进行了分析,结果表明石刁柏核型公式为2n=2x=20=10m +10sm,核型类型为2B型,属于较原始的类型。减数分裂过程中发现了异型性染色体的分离行为。证明了石刁柏的性染色体为异形染色体,雌株为XX,雄株为XY,且Y染色体是X染色体长度的1.65倍;G带和DAPI带显示其X染色体和Y染色体均富含异染色质。2、石刁柏雌雄株花分化时期的内源代谢产物差异比较。对石刁柏花分化的营养生长、两性期、减数分裂及花成熟期四个时期的内源激素、多胺、氨基酸含量进行比较分析,结果发现所研究的几种内源代谢产物均参与了性别的分化过程。雌雄性个体单性性别形成的四个时期中,碱性氨基酸和中性氨基酸在四个时期的总量变化规律没有性别的差异。而酸性氨基酸的变化趋势和雌性性别存在明显的差异,氨基酸总量在四个时期雄株含量明显高于雌株。碳氮化合物含量在雌雄性性别分化过程中均没有明显的变化。而C/N比值在雄性性别分化中从营养生长、两性期到减数分裂期,C/N比值显著降低,而到花完全成熟时期又开始回升,而雌性变化不显著。IAA在雌雄单性花分化中其含量变化规律没有性别差异,GA3、ZRs和ABA含量在花分化过程中含量变化表现出雌雄差异,其差异主要表现在单性花生理分化结束后,说明内源激素并没参与单性花性别的决定过程。腐胺和亚精胺含量在单性花分化过程中没有明显的性别差异;精胺含量在雌雄单性花分化中其含量变化表现出明显的性别差异,雄性个体在小孢子时期达到最低值,此后又显著上升。而雌性则相反,随着雌性性别的分化精胺含量逐渐从最大值开始降低。多胺总量变化也表现出性别差异,多胺总量随着生殖器官的分化而逐渐升高,到花完全成熟期达到最大值;而在雌株中,多胺总量的最大值出现在两性期的转换期,而此后又逐渐降低。3、利用随机扩增多态性DNA技术对石刁柏雌雄株基因组差异进行了分析,结果发现,在100个随机引物中,引物S368在石刁柏基因组中扩增出2条雌性相关的RAPD片断,它们长度分别为928bp、1178bp,AT含量分别为62%、64%,Genbank检索未发现同源片断。通过设计特异引物将S368928片段成功转化为稳定性更高的SCAR标记。Southern杂交表明S368928片段在雌雄基因组中均有杂交信号,属于是多拷贝的重复序列。通过荧光原位杂交进行染色体定位发现该标记在雄性中两对常染色体、X和Y染色体上出现杂交信号,雌性中的杂交信号出现在两对对常染色体和X染色体上。X、Y染色体以及一对常染色体上的杂交信号出现在着丝粒附近,而另一对常染色体的杂交信号出现在末端。4、利用限制性片段长度多态性技术对石刁柏雌雄株基因组差异进行了分析,结果发现,在使用的72个引物组合中,引物组合E-AAG + M-CAT从雄性基因组中扩增出了一个555bp的雄性连锁的片段（MLDA555）,将获得的差异条带进行克隆测序发现该序列长度为555bp,AT含量为59%,经过检索未发现同源序列。根据该片段序列设计的引物将该标记转化为雄性连锁的大小为523bp的SCAR标记,经过不同基因型雄性个体的验证证明该标记广泛存在于不同基因型石刁柏雄性个体中。Southern杂交仅在雄性基因组中出现低拷贝的杂交信号。荧光原位杂交发现,在雄性细胞中仅有Y染色体出现杂交信号,在雌性细胞中未出现杂交信号,说明该标记是个Y染色体连锁的低拷贝重复序列。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 雌雄异株植物性别表现的多样性
• 1.2 雌雄异株植物性别决定的多态性
• 1.2.1 性染色体控制的性别决定系统
• 1.2.2 基因平衡的性别决定系统
• 1.2.3 性别决定基因控制的性别决定系统
• 1.3 雌雄异株植物的性染色体研究
• 1.4 雌雄异株植物性别的发育及表达修饰
• 1.4.1 雌雄异株植物的性别发育
• 1.4.2 雌雄异株植物的性别表达修饰
• 1.5 雌雄异株植物性别发育中的雌雄生理差异
• 1.5.1 内源激素在植物性别发育中的不同作用
• 1.5.2 同工酶在雌雄个体中的差异表达
• 1.5.3 雌雄性别分化过程中的特异蛋白质
• 1.6 雌雄异株植物性别连锁的DNA 标记
• 1.6.1 随机扩增DNA 多态性标记（RAPD）
• 1.6.2 简单重复序列（SSR）
• 1.6.3 Y 染色体特有的重复序列
• 1.6.4 染色体间隙类端粒重复序列（ITRs）及ITR 邻近序列（IASs）
• 1.7 AFLP 标记及其在雌雄异株植物性别研究中的应用
• 1.7.1 AFLP 的基本原理
• 1.7.2 AFLP 技术在雌雄异株植物性别研究中的应用
• 1.8 雌雄异株植物性别决定相关的功能基因
• 1.8.1 SlX/SlY
• 1.8.2 DD44X/DD44Y
• 1.8.3 MROS3
• 1.8.4 ORF162
• 1.8.5 MADS-box 基因
• 1.9 本研究的目的及意义
• 1.9.1 石刁柏性染色体的细胞学研究
• 1.9.2 石刁柏性别发育关键时期的内源激素、多胺的差异比较
• 1.9.3 石刁柏性别连锁的分子标记
• 第二章 石刁柏性染色体的细胞学研究
• 前言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 核型和性染色体分析
• 2.2.2 花粉母细胞减数分裂结果与分析
• 2.2.3 染色体的DAPI 带型分析
• 2.2.4 雄性染色体的尿素-G 带分析
• 2.3 讨论
• 第三章 石刁柏性别分化过程中内源物质含量动态变化
• 前言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 雌雄性别分化过程中氨基酸动态变化比较
• 3.2.2 雌雄性别分化过程中碳氮含量的动态变化
• 3.2.3 雌雄性别分化过程中内源激素含量的变化
• 3.2.4 雌雄性别分化过程中内源多胺含量的变化
• 3.3 讨论
• 第四章 石刁柏性别连锁的RAPD 标记
• 前言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 随机引物的筛选
• 4.2.2 雌性连锁片段的扩增
• 4.2.3 重组克隆的筛选与鉴定
• 4.2.4 雌性性别连锁标记的序列分析
• 4.2.5 SCAR 标记的建立及Southern 杂交结果
• 928 荧光原位杂交分析'>4.2.6 S368₉₂₈荧光原位杂交分析
• 4.3 讨论
• 第五章 石刁柏性别连锁的AFLP 分子标记
• 前言
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 模板DNA 的制备
• 5.2.2 AFLP技术体系的优化
• 5.2.3 性别连锁的AFLP 标记的扩增
• 5.2.4 AFLP 雄性特异条带的分析
• 5.2.5 DNA 测序和序列分析
• 5.2.6 SCAR 标记的建立
• 5.2.7 MLDA555 标记的Southern 杂交及荧光原位杂交结果分析
• 5.3 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介及博士在读期间科研成果