甜菜M14品系表达基因M14-100、M14-265、M14-G12 cDNA全长克隆与序列分析

论文摘要

甜菜M14品系是由栽培甜菜（Beta vulgaris L.）与野生白花甜菜（Beta corolliflora Zoss.）种间杂交,进一步回交获得的甜菜无融合生殖单体附加系,其染色体组除了含有18条栽培甜菜染色体外,还附加有白花甜菜第9号染色体,附加染色体的传递率高达96.5%,如此高的传递率是由于附加的第9号染色体携带无融合相关基因所致。因此,甜菜M14品系是无融合生殖研究极其难得的材料。同时,甜菜M14品系还具有抗寒、抗病的优良性状,对M14品系特异表达基因的研究,也有助于我们挖掘和利用甜菜M14品系具有的优良基因。为了克隆甜菜M14品系中无融合生殖相关基因,实验室前期采用抑制消减杂交方法获得了298个甜菜M14品系特异表达的ESTs。本研究挑选其中3个有研究价值的ESTs作为侯选ESTs,采用SMART RACE技术获得了侯选ESTs所在基因——M14-100、M14-265和M14-G12的cDNA全长,并采用RT-PCR法进行验证,最后对三个目的基因的cDNA全长进行了生物信息学分析。M14-100 cDNA全长1 707bp,GenBank数据库接受号为EU529829,经过生物信息学分析,该基因序列与来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的细胞周期蛋白相关基因序列有6070%的相似性,但该基因的功能目前还不清楚;M14-100 cDNA最长读码框编码324个氨基酸;推定编码蛋白的分子量为34.4 kD,理论等电点5.11,有较强的亲水性;为非分泌型蛋白;推定蛋白二级结构分析结果表明,含有6个α-螺旋和3个β-折叠。M14-265 cDNA全长1 006bp,GenBank数据库接受号为EU529830,经生物信息学分析认为该基因是一个新基因;缺乏明显的读码框,最长读码框仅编码81个氨基酸,可能以RNA的形式参与生命活动,也可能编码短肽;推定编码蛋白的分子量为9.3 kD,理论等电点4.69,为非分泌型蛋白;推定蛋白的二级结构预测表明,该蛋白含有1个α-螺旋和2个β-折叠。M14-G12 cDNA全长873bp,GenBank数据库接受号为EU529828,与来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的钙调蛋白基因的氨基酸序列相似性达到99%,可以认定该基因即是来自甜菜M14的钙调蛋白基因;该基因编码149个氨基酸,分析结果显示其编码蛋白分子量为16.8 kD,理论等电点4.11,总平均亲水性为-0.620;二级结构预测发现该蛋白质是一个富含α-螺旋的蛋白质。三级结构预测,该蛋白包含4个螺旋-环-螺旋结构,与钙调蛋白的功能特征相符合。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 植物无融合生殖
• 1.1.1 植物无融合生殖的概念及分类
• 1.1.2 植物无融合生殖的重要意义
• 1.1.3 无融合生殖的研究进展
• 1.1.4 无融合生殖甜菜单体附加系M14 品系
• 1.2 cDNA 末端快速扩增技术
• 1.2.1 RACE 技术的基本原理和方法
• 1.2.2 RACE 技术的优化与改良
• 1.2.3 SMART RACE
• 1.2.4 “电子”基因克隆
• 1.3 生物信息学应用概述
• 1.4 本实验的内容及目的
• 1.5 实验技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 候选ESTs
• 2.1.3 试剂盒与菌株
• 2.1.4 药品
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 甜菜M14 品系花器总RNA 的提取及检测
• 2.2.2 甜菜M14 品系花器总RNA 的反转录
• 2.2.3 RACE 法克隆基因M14-100 cDNA 末端
• 2.2.4 RACE 法克隆基因M14-265 cDNA 末端
• 2.2.5 RACE 法克隆基因M14-G12 cDNA 末端
• 2.2.6 目的基因cDNA 全长序列的拼接
• 2.2.7 目的基因cDNA 全长序列的RT-PCR 验证
• 2.2.8 目的基因cDNA 全长序列的生物信息学分析
• 第3章 结果与分析
• 3.1 甜菜M14 品系花器总RNA 的提取及检测
• 3.1.1 总RNA 的定量
• 3.1.2 总RNA 完整性检测
• 3.2 RACE 法克隆基因M14-100 cDNA 末端
• 3.3.1 3′RACE 克隆基因M14-100 cDNA 3′末端
• 3.2.2 5′RACE 克隆基因M14-100 cDNA 5′末端
• 3.2.3 目的片段的转化与重组体的筛选
• 3.2.4 目的片段的测序
• 3.3 RACE 法克隆基因M14-265 cDNA 末端
• 3.3.1 3′RACE 克隆基因M14-265 cDNA 3′末端
• 3.3.2 5′RACE 克隆基因M14-265 cDNA 5′末端
• 3.3.3 目的片段的转化与重组体的筛选
• 3.3.4 目的片段的测序
• 3.4 RACE 法克隆基因M14-G12 cDNA 末端
• 3.4.1 3′RACE 克隆基因M14-G12 cDNA 3′末端
• 3.4.2 5′RACE 克隆基因M14-G12 cDNA 5′末端
• 3.4.3 目的片段的转化与重组体的筛选
• 3.4.4 目的片段的测序
• 3.5 目的基因cDNA 全长序列的拼接
• 3.6 目的基因cDNA 全长序列的RT-PCR 验证
• 3.7 目的基因的生物信息学分析
• 3.7.1 基因M14-100 的生物信息学分析
• 3.7.2 基因M14-265 的生物信息学分析
• 3.7.3 基因M14-G12 的生物信息学分析
• 第4章 讨论
• 4.1 RACE 技术中常见的问题及改进方法
• 4.2 关于M14-G12 基因
• 4.3 关于M14-265 基因
• 4.3.1 M14-265 可能是类似于mRNA 的非编码RNA
• 4.3.2 M14-265 可能是短可读框编码RNA
• 4.4 后续思路
• 4.4.1 对M14-100 基因的后续工作思路
• 4.4.2 对M14-265 基因的后续工作思路
• 4.4.3 对M14-G12 基因的后续工作思路
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文