论文摘要
研究背景随着人类预期寿命的不断延长、老年人口比例的不断增加,伴随而来的与增龄相关的老年疾病也在明显增多,老年病已成为当今社会老龄化中的突出问题。心血管病（CVD）是老年人死亡的主要原因。目前已知衰老是缺血性心脏病患者发病率和死亡率增高的一个独立危险因子。但是,这个与增龄相关的心血管病理改变的原因目前仍有很多不清楚的地方。大量研究表明基因调控的程序性细胞死亡、心肌细胞凋亡在衰老时显著增加。然而,是什么分子经过何种途径导致衰老心肌细胞对凋亡的敏感性增加,目前仍有待进一步研究。硫氧还蛋白（Trx）是一个12-kDa的小分子蛋白,其在机体所有细胞内广泛分布,Trx的生物活性与细胞增殖和细胞凋亡有关。Trx不仅可通过抗氧化作用实现细胞保护功能,还参与了调控细胞的增殖分化及衰老的过程。临床和动物研究已经证明抑制Trx的活性可以促进细胞凋亡的发生。近来,体外研究已经证实Trx直接参与并可抑制凋亡信号调节激酶1 （ASK1）的活性。ASK1是一种有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）,其活化可以激活p38 MAPK和c-Jun氨基端激酶（JNK）两个促凋亡蛋白激酶。在老年大鼠肝脏,ASK1/Trx–ASK1（游离的ASK1与Trx结合的ASK1）的比值增加,并且这一比值和p38 MAPK通路的活性正相关。以上结果提示Trx在机体衰老时细胞的增殖和细胞的死亡过程中有重要作用。但是,在衰老时Trx的活性是否会降低及其活性降低是否会促进衰老时心肌细胞凋亡的发生目前尚未见报道。长期以来认为活性氧基团（ROS）可以引起蛋白质氧化从而改变其生物活性,从而在机体的老化过程中扮演重要角色。然而,心脏衰老后对心肌缺血/再灌注损伤（RMMI）易感性增加和缺血后心肌细胞凋亡增加很难单纯用活性氧基团的生成增加来解释。近期研究发现一氧化氮（NO）生成增加可以促进活性氮集团（RNS）（如过氧亚硝酸阴离子,ONOO-）的堆积,后者可以使蛋白质发生硝基化修饰,从而引起细胞损伤。干预蛋白质的硝基化修饰可能成为一种治疗RMMI的手段。然而,衰老引起的RNS堆积是否可使某个蛋白质发生硝基化修饰从而引起心肌细胞的凋亡增加目前尚未见报道。研究目的1.观察在老年心脏组织中Trx的活性是否降低。2.寻找衰老引起Trx活性降低的原因。3.明确在老年心脏中Trx活性减退导致的细胞凋亡增加及引起心肌细胞死亡的信号转导机制。4.验证在老年心脏给予FP-15（ONOO-清除剂）是否可抑制Trx的硝基化,抑制凋亡所致的心肌细胞死亡的发生。实验方法1、实验方案:雄性成年（3 months）和老年（20 months）C57/B16小鼠麻醉后,结扎冠状动脉使心肌缺血30 mins后再灌注3或24 hrs,在再灌注前10 mins,小鼠腹腔注射磷酸缓冲液（pH 7.5）或FP-15（ONOO-清除剂,5 mg/kg）。在再灌注结束后,心脏被迅速摘除,再灌注3hrs后的缺血心肌组织用于凋亡和分子生物学实验。再灌注24hs的心脏组织用于检测心肌梗死（MI）面积。2、总NO含量测定:心脏组织加入细胞裂解液后匀浆,离心后取上清与硝基还原酶共孵育2hrs使NO3还原为NO2,含有NO2的样品被加入到还原液中（120 mM的KI醋酸溶液中）,依据化学发光原理用NO分析仪测定NO含量（A 280I; Sievers, Boulder, CO）。ONOO-的含量测定是用酶联免疫吸附实验（ELISA）。3、Trx的硝基化和Trx-ASK1结合率的测定:用鼠的单克隆Trx-1抗体（Redox Bioscience）和免疫沉淀方法获取组织中的总的Trx。Trx-1硝基化使用抗ONOO-单克隆抗体（Upstate）检测,Trx-1–ASK1的结合使用抗ASK1单克隆抗体检测。使用Supersignal-Western reagent （Pierce）显色。4、p38 MAPK活性测定:心脏组织在0.5 ml预冷的细胞裂解液中匀浆,免疫沉淀是使用单克隆抗磷酸化p38 MAPK（Thr180/Tyr182）抗体在组织裂解液中获取磷酸化p38 MAPK,激酶反应是在200μM ATP和2μg的p38磷酸化激活转录因子2（ATF-2）蛋白环境下30°C孵育30mins,ATF-2是p38 MAPK的底物蛋白。反应后的样品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,按常规Western操作步骤使用单克隆抗体检测磷酸化的ATF-2表达。5、RMMI后心肌细胞凋亡检测:心肌细胞凋亡检测使用TUNEL染色和半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）活性。6、心肌细胞梗死测定:再灌注24h后,动物麻醉后冠脉主干被重新结扎,左心室中注入2%伊文氏兰0.5ml,心脏被摘除后使用三苯四唑氯盐（TTC）测定MI面积。实验结果1、衰老促进了RMMI:老年动物心肌细胞较年轻动物在RMMI后细胞凋亡增加（TUNEL,5.0±1.8% vs. 8.8±0.9%; caspase 3活性,18.0±0.9 nmol/h/mg protein vs. 27.4±1.9 nmol/h/mg protein,P<0.01,n=8）,导致衰老心肌细胞损伤加重,MI面积加大（38.5±2.7% vs. 52.0±1.8%,P<0.01,n=8）。2、衰老心肌组织中Trx表达增加而其活性反而降低:和成年动物相比,老年动物的Trx的活性在心肌缺血/再灌注（MI/R）前就已经减低（2.57±0.07μmol/min/mg vs. 1.85±0.05μmol/min/mg,n=8,P<0.01 ）,在MI/R后Trx的活性进一步减低（1.14±0.05μmol/min/mg vs. 0.50±0.05μmol/min/mg,n=8,P<0.01）,成年和老年动物Trx活性间的差异进一步扩大。但Trx蛋白的表达在老年动物心肌组织中不仅没有降低,反而轻微升高（4.04±0.15 AU vs. 4.79±0.16 AU,n=6-8,P<0.05）。这些结果表明在老年动物,心肌组织中Trx活性的降低不是因为Trx的生成减少所致,而是因为Trx蛋白活性减低所致。3、在老年动物的心肌组织中活性氮集团（RNS）的生成和Trx的硝基化水平均增高,Trx–ASK1的结合被抑制,p38 MAPK活性增加:心肌组织中总的NO含量和硝基酪氨酸的含量检测显示,在MI/R之前两者均有约1.5倍的增高。老年心肌较成年动物心肌组织,在RMMI后可进一步促进硝基酪氨酸的生成（0.26±0.01 pmol/mg protein vs. 0.20±0.01 pmol/ mg protein, P<0.05,n=8）。在MI/R前,成年动物心脏中未能检测到Trx的硝基化,而在老年动物心肌组织中则可以检测到硝基化的Trx（0.69±0.28 AU, n=8）,而且这种衰老所致的Trx硝基化在RMMI后可被进一步强化（0.69±0.28 AU vs. 7.44±0.31 AU, P<0.01,n=6）。在成年动物心肌组织中,Trx可以和ASK1结合（免疫沉淀抗Trx-1,Western抗ASK1）,而在老年动物MI/R前,Trx和ASK1的结合就显著降低（28.35±2.56 AU vs. 21.35±2.75 AU, P<0.01,n=6）;和成年动物相比,老年动物ASK1下游的促凋亡分子p38 MAPK的活性则显著增加（4.24±0.47 AU vs. 7.44±1.56 AU, P<0.01,n=8）。4、在老年动物给予ONOO-的清除剂可阻止Trx的硝基化,抑制心脏的RMMI:在再灌注前10 mins给予FP-15可以抑制Trx的硝基化,保存Trx的活性,恢复Trx-ASK1的结合,降低p38 MAPK激酶的激活,抑制caspase 3的活性,从而降低老年动物RMMI后MI面积（52±2.2% vs.. 27.9±1.9%, P<0.05,n=8）。结论1、本研究首先发现在MI/R前,老年动物心肌组织中具有抗氧化和抗凋亡生物活性的小分子蛋白Trx的活性就已经显著降低。2、本研究首先揭示老年动物在MI/R前和RMMI后,其心肌组织中Trx活性降低不是因为Trx表达的减少,而是因为衰老引起的Trx硝基化修饰增加所致。3、本研究进一步证实了衰老引起的Trx硝基化修饰增加可以降低Trx和ASK1的结合。如在RMMI前给予ONOO-清除剂,则可以阻止Trx的硝基化,抑制ASK1的活性,降低老年心肌缺血后心肌细胞凋亡的发生,减少MI面积,从而为治疗老年RMMI提供了新的治疗途径。