乳酸杆菌对鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9基因表达的影响

论文摘要

肠道上皮细胞作为机体防御的第一道防线,其产生的抗菌肽是肠道黏膜天然免疫的重要成分,具有广谱性、高效性、稳定性及不易产生抗药性等特点。β-防御素AvBD9是鸡小肠上皮细胞中具有诱导表达特点的重要抗菌肽,对维持肠道微生态平衡和免疫稳态发挥重要作用。益生乳酸杆菌作为鸡小肠的优势菌群,通过黏附作用附着在上皮细胞表面并与之发生相互作用,调节上皮细胞的生理功能。本实验采用体外培养的肠黏膜上皮细胞模型研究乳酸杆菌对抗菌肽AvBD9基因表达的影响。通过摸索上皮细胞分离方法与最适培养条件,成功建立了体外鸡胚肠上皮细胞原代培养模型。分离的细胞接种培养12-24h贴壁,48-72h细胞团向四周蔓延,形成一群一群的细胞集落,6-7d细胞汇合成片,呈“铺路石样”生长,经碱性磷酸酶染色及免疫组化鉴定,上皮细胞纯度为85%以上。以pGEX-6P-1为载体,构建重组表达载体pGEX6P-AvBD9,在大肠杆菌细胞中表达,表达蛋白以包涵体形式存在。通过切胶纯化获得GST-AvBD9融合蛋白免疫新西兰大白兔,应用间接ELISA及Westernblot方法检测证实,用切胶纯化获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔得到了特异性的多克隆抗体。这些研究结果为进一步从蛋白水平检测抗菌肽AvBD9蛋白表达差异打下了基础。选用7株益生性乳酸杆菌和1株益生性肠球菌对体外培养的肠上皮细胞进行剂量依赖性及时间依赖性刺激实验,利用实时荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR）从mRNA水平研究刺激后上皮细胞抗菌肽AvBD9基因表达水平的差异。结果表明,AvBD9 mRNA的表达在不同菌株及不同浓度之间存在差异。发酵乳杆菌F6、鼠李糖乳杆菌MLGA、鼠李糖乳杆菌MB12、植物乳杆菌SJ和屎肠球菌DM5均能不同程度地提高AvBD9 mRNA的表达。其中,鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus） MLGA上调AvBD9表达的能力最强。热灭活鼠李糖乳杆菌MLGA亦能上调AvBD9基因表达,且上调值显著高于活菌（p<0.05）。鼠李糖乳杆菌MLGA刺激上皮细胞后AvBD9表达存在时间依赖关系,12h时AvBD9的表达达到峰值。Western blot检测显示,鼠李糖乳杆菌MLGA刺激后的上皮细胞培养上清中存在AvBD9蛋白表达,表明AvBD9蛋白可以分泌到细胞外。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写表
• 第一章 绪论
• 1 肠上皮细胞培养现状
• 1.1 小肠上皮细胞的结构
• 1.2 IEC的主要功能
• 1.3 IEC的体外培养
• 1.4 IEC培养的研究现状
• 2. 益生菌与抗菌肽的关系
• 2.1 抗菌肽
• 2.1.1 抗菌肽分类及抗菌作用
• 2.1.2 展望
• 2.2 益生菌
• 2.2.1 益生菌的作用
• 2.2.2 乳酸杆菌形态
• 2.3 乳酸杆菌与肠上皮细胞黏附关系
• 2.3.1 乳酸杆菌作用于上皮细胞的机理
• 2.3.2 乳酸杆菌黏附具有菌株差异性
• 3. 实时荧光定量
• 3.1 FQ-PCR技术的原理
• 3.2 FQ-PCR技术的两种定量形式
• 3.3 FQ-PCR技术的主要种类
• 3.4 FQ-PCR的应用
• 4. 包涵体（inclusion body）蛋白纯化
• 4.1 包涵体蛋白的形成
• 4.2 包涵体的分离纯化
• 4.2.1 包涵体的分离
• 4.2.2 包涵体的纯化
• 5. 研究的目的及意义
• 第二章 鸡胚小肠上皮细胞的分离及原代培养
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.1.4 试剂配制
• 1.2 方法与步骤
• 1.2.1 小肠上皮细胞的分离与培养
• 1.2.2 细胞生长与增殖
• 1.2.3 小肠上皮细胞形态学观察
• 1.2.4 小肠上皮细胞鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 鸡小肠上皮细胞的分离
• 2.2 鸡小肠上皮细胞形态特征
• 2.3 细胞的生长及增殖
• 2.4 上皮细胞鉴定结果
• 2.4.1 碱性磷酸酶鉴定结果
• 2.4.2 免疫组化鉴定结果
• 3 讨论
• 3.1 鸡小肠上皮细胞的分离
• 3.1.1 材料来源及取材要求
• 3.1.2 消化酶的选择及消化时间的确定
• 3.2 各添加因素对鸡胚小肠上皮细胞培养的影响
• 3.3 小肠上皮细胞的纯化
• 4 小结
• 第三章 鸡抗菌肽AvBD9的融合表达及其多克隆抗体制备与鉴定
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 载体及宿主
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.1.5 试剂配制
• 1.2 实验方法与步骤
• 1.2.1 重组载体的构建
• 1.2.2 融合蛋白的诱导表达及AvBD9蛋白分离、纯化
• 1.2.3 多克隆抗体的制备
• 1.2.4 抗血清的抗体滴度测定
• 1.2.5 Western-blot检测抗体特异性
• 2 结果及分析
• 2.1 重组质粒pGEX-6P-AvBD9的鉴定
• 2.2 融合蛋白的分离与纯化
• 2.2.1 融合蛋白分离与鉴定
• 2.2.2 融合蛋白纯化
• 2.2.3 纯化的GST-AvBD9蛋白浓度测定
• 2.2.4 GST-AvBD9抗血清效价的测定
• 2.2.5 Western-blot鉴定结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 乳酸杆菌对鸡小肠上皮细胞抗菌肽AvBD9基因表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 小肠上皮细胞及供试菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 乳酸杆菌的培养与鉴定
• 1.2.2 抗菌肽AvBD9 mRNA表达水平的检测
• 1.2.3 Tricine-SDS-PAGE蛋白质电泳
• 1.2.4 Western blot检测培养上清中AvBD9的表达
• 1.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 乳酸杆菌的鉴定
• 2.2 肠上皮细胞总RNA的提取
• 2.3 实时荧光定量PCR结果
• 2.3.1 不同浓度的活乳酸杆菌对AvBD9 mRNA表达的影响
• 2.3.2 鼠李糖乳杆菌MLGA刺激时间与AvBD9 mRNA表达水平的关系
• 2.3.3 乳酸杆菌MLGA活菌及其灭活菌与AvBD9 mRNA表达水平的关系
• 2.4 Western blot检测培养上清中AvBD9蛋白的表达
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢