AP-2α在动脉粥样硬化和HeLa细胞凋亡中的作用

论文摘要

第一部分转录因子AP-2α通过直接调节CD36参与动脉粥样硬化目的:转录因子激活蛋白-2α（AP-2α）在发育、分化和肿瘤过程中调节细胞型别的特异性基因的表达,但迄今为止,还未见AP-2α在动脉粥样硬化中发挥作用的相关报道。目前的研究在于探讨AP-2α通过直接调节CD36基因在动脉粥样硬化的泡沫细胞形成中发挥的潜在作用。方法:本研究应用免疫组化和双免疫荧光染色检测AP-2α在apoE-/-小鼠和人动脉粥样硬化病变的表达;相对定量PCR、westernblot和免疫荧光染色检测AP-2α对大鼠血管平滑肌细胞表达CD36的影响;油红O染色和高效液相色谱分析法测量大鼠血管平滑肌细胞内的脂质蓄积;萤光素酶分析试验、电泳迁移率变动分析试验和染色质免疫沉淀法用于证明AP-2α对CD36基因启动子的直接调节。结果:AP-2α主要在apoE-/-小鼠和人动脉粥样硬化病变的泡沫细胞内高表达。AP-2α上调大鼠血管平滑肌细胞CD36基因的mRNA和蛋白表达并促进大鼠血管平滑肌细胞内的脂质蓄积。AP-2α过表达能增强CD36基因启动子活性,在CD36基因启动子区域存在两个AP-2结合位点,突变这两个结合位点能削弱AP-2α对CD36基因启动子活性的增强效应。结论:AP-2α通过直接调控CD36基因的表达来增加细胞对脂质的摄取,从而在动脉粥样硬化的形成中发挥了作用。第二部分转录因子AP-2α参与多沙唑嗪诱导的HeLa细胞凋亡目的:研究α1-肾上腺素受体拮抗剂多沙唑嗪对HeLa细胞凋亡的影响以及转录因子AP-2α在多沙唑嗪诱导的HeLa细胞凋亡中发挥的作用。方法:不同浓度的多沙唑嗪处理HeLa细胞16h,通过DNA片断形成分析、Hoechst 33258染色和流式分析检测多沙唑嗪对HeLa细胞凋亡的影响;以相对定量PCR和Western blot分析检测AP-2α和caspase-3的表达。以AP-2α过表达质粒或反义AP-2α寡核苷酸分别转染HeLa细胞后,通过流式检测凋亡效应;相对定量PCR和Western blot分析检测AP-2α和caspase-3的表达;比色法检测caspase-3的酶活性。结果:多沙唑嗪以剂量依赖性方式增加HeLa细胞的凋亡率和总细胞死亡率,并以剂量依赖性方式上调AP-2α和caspase-3的表达,caspase-3的活性也呈剂量依赖性方式增长。AP-2α的过表达导致多沙唑嗪诱导的HeLa细胞的凋亡率和总细胞死亡率增加,而反义AP-2α却导致多沙唑嗪诱导的HeLa细胞的凋亡率和总细胞死亡率降低。此外,过表达的AP-2α增强caspase-3的表达和活性,而反义AP-2α部分地阻断了多沙唑嗪对caspase-3表达及活性的增强效应。结论:多沙唑嗪以剂量依赖性方式诱导HeLa细胞凋亡,转录因子AP-2α在多沙唑嗪诱导的HeLa细胞凋亡中发挥了作用。

论文目录

• 英文缩写表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 综述
• 1.转录因子AP-2概述
• 1.1 AP-2家族的结构
• 1.2 AP-2与胚胎发育
• 1.3 AP-2调控细胞生长
• 1.4 AP-2与肿瘤
• 2.动脉粥样硬化概述
• 2.1 AS的流行病学及危险因素
• 2.2 AS的病理变化
• 3.AP-2与AS相关基因的联系
• 3.1 AP-2与apoE
• 3.2 AP-2与MMP
• 3.3 AP-2与脂联素
• 3.4 AP-2与VEGF
• 3.5 AP-2与ABCA1
• 4.小结
• 5.参考文献
• 第一部分 转录因子AP-2α通过直接调节CD36参与动脉粥样硬化
• 前言
• 材料与方法
• 1.仪器设备
• 2.材料与试剂
• 3.实验方法
• 3.1 载体构建和寡核苷酸合成
• 3.2 细胞培养与瞬时转染
• 3.3 oxLDL的制备和鉴定
• 3.4 免疫组化染色
• 3.5 原位杂交检测
• 3.6 RNA抽提和相对定量RT-PCR
• 3.7 免疫沉淀和Western Blot检测
• 3.8 细胞免疫荧光
• 3.9 油红0染色检测细胞内中性脂质
• 3.10 高效液相色谱（HPLC）检测细胞内胆固醇及胆固醇酯含量
• 3.11 萤光素酶试验（Luciferase assay）
• 3.12 电泳迁移率变动分析试验（EMSA）
• 3.13 染色质免疫沉淀（ChIP）
• 4.统计学分析
• 实验结果
• 1.AP-2α在AS病变血管内表达
• 2.AP-2α对大鼠血管平滑肌细胞表达CD36的影响
• 3.AP-2α对oxLDL诱导大鼠血管平滑肌细胞积蓄脂质的影响
• 4.AP-2α结合到CD36的启动子区域
• 5.CD36基因启动子区域AP-2结合位点的鉴定
• 6.AP-2α对ABCA1的mRNA水平的影响
• 7.多沙唑嗪对AP-2α调控CD36和ABCA1的影响
• 讨论
• 1.转录因子在AS中的作用
• 1.1 NF-κB在AS中的作用
• 1.2 PPAR在AS中的作用
• 2.转录因子AP-2α在AS中的可能作用
• 3.以转录因子为靶标防治AS疾病
• 3.1 NF-κB作为药物治疗靶点的研究
• 3.2 PPAR作为药物治疗靶点的研究
• 3.3 AP-2α可望作为药物治疗靶点的研究
• 第二部分 转录因子AP-2α参与多沙唑嗪诱导的HeLa细胞凋亡
• 前言
• 材料与方法
• 1.仪器设备与试剂配制
• 2.实验方法
• 2.1 质粒构建、寡核苷酸合成以及药品
• 2.2 细胞培养和瞬时转染
• 2.3 RNA抽提和相对定量RT-PCR
• 2.4 Western blot分析
• 2.5 DNA ladder检测
• 2.6 Hoechst 33258染色
• 2.7 流式分析
• 2.8 Caspase-3活性分析
• 2.9 统计学分析
• 实验结果
• 1.多沙唑嗪以剂量依赖性方式诱导HeLa细胞凋亡
• 2.AP-2α参与多沙唑嗪诱导的HeLa细胞凋亡
• 3.多沙唑嗪上调AP-2α在HeLa细胞内的表达
• 4.多沙唑嗪在HeLa细胞内通过AP-2α影响caspase-3路径
• 讨论
• 结语
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间已发表及待发表的学术论文